MEKK1 Antibody (Mouse mAb) [B14N1]
目录号: F4937
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A431
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:100
建议曝光 60s 以上。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:100
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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164 kDa
195 kDa, 80 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | C4 cells; NRK cells; A‑431 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MEKK1 Antibody (Mouse mAb) [B14N1] 可检测内源性 MEKK1 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13233 |
| 克隆号 |
|---|
| B14N1 |
| 别名 |
|---|
| Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, MAPK/ERK kinase kinase 1 (MEK kinase 1; MEKK 1), MAP3K1, MAPKKK1, MEKK, MEKK1 |
| 背景 |
|---|
| MEKK1，又称MAP3K1，是一种MAP激酶激酶激酶，它通过其作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和RING/PHD型E3泛素连接酶的双重功能，将生长因子、细胞因子和应激信号的受体与下游的MAPK和NF-κB通路连接起来。该蛋白包含一个N端调控和支架区，该区域具有多个对接基序；一个具有RING样E3连接酶活性的中央植物同源结构域（PHD）；以及一个C端激酶结构域，该结构域可磷酸化特定的MAP2K，包括MEK1/2（MAP2K1/2）和MKK4/7（MAP2K4/7），进而激活ERK1/2和JNK MAPK。 MEKK1与TRAF2、Grb2等上游衔接蛋白以及小GTP酶结合，并被募集到TNF受体家族成员、T细胞受体、EGFR和TGFβ受体下游的受体复合物中；在这些复合物中，MEKK1既作为支架蛋白，又作为催化激酶，响应促有丝分裂和应激信号，组织并激活ERK和JNK信号通路。该激酶还通过磷酸化IKK复合物上游的组分，以及在TNFα刺激、渗透压或细胞骨架应激等条件下参与AP-1和NF-κB转录因子的信号传导，从而促进NF-κB通路的激活。 MEKK1的PHD/RING结构域作为E3泛素连接酶，与包括UBE2D家族成员和UBE2N复合物在内的泛素结合酶相互作用，催化c-Jun等底物和其他信号蛋白的泛素化，从而调节它们的稳定性和活性。该结构域与激酶结构域共同作用，是MAPK完全激活所必需的。在Fas和应激诱导的细胞凋亡过程中，MEKK1被caspase水解，产生一个活性激酶片段，该片段可转位并放大JNK和应激激活通路信号，从而将caspase激活与MAPK驱动的细胞凋亡程序联系起来。MEKK1在细胞高渗和微管破坏应激下调节细胞存活。此外，MEKK1还控制干扰素-γ诱导的C/EBPβ依赖性转录，并通过与启动子结合的p53相互作用抑制PKD1等启动子的活性。 |
| 参考文献 |
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