MERIT40 Antibody [B22L22]
目录号: F8556
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: LNCAP, Lane 3: A431, Lane 4: COS-7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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40 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; LNCaP cells; A-431 cells; COS-7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MERIT40 Antibody [B22L22] 可检测内源性 MERIT40 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9NWV8 |
| 克隆号 |
|---|
| B22L22 |
| 别名 |
|---|
| Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 40; BRISC and BRCA1-A complex subunit 1; BABAM1; MERIT40 |
| 背景 |
|---|
| MERIT40（NBA1，RAP80相互作用和靶向40 kDa的介质）是一种支架蛋白，参与BRCA1-A复合物的形成。BRCA1-A复合物是一个多亚基组装体，连接DNA损伤信号与BRCA1依赖性修复和检查点调控。MERIT40包含一个中央卷曲螺旋结构域和一个C端PXXR基序，该基序介导其与BRE/BRCC45以及BRCA1-A复合物的其他核心组分（包括RAP80、Abraxas、BRCC36和CBP/p300结合蛋白）的直接相互作用。这些相互作用对于维持复合物在DNA双链断裂位点的稳定性和化学计量比至关重要。 MERIT40定位于DNA损伤诱导的核内聚集灶，其存在对于BRCA1在断裂位点周围染色质上的正确募集和滞留、RAP80和BRCA1辐射诱导聚集灶的形成、BRCA1依赖的G2/M期检查点激活以及对电离辐射的抵抗至关重要。在DNA损伤信号传导过程中，MERIT40在基因毒性应激下被Akt磷酸化，其Ser29位点发生磷酸化。这种磷酸化开关促进MERIT40与Rap80和其他BRCA1-A亚基的结合增强，从而促进DNA损伤依赖的复合物组装，并支持DNA损伤的有效修复和细胞存活。含MERIT40的BRCA1-A复合物的改变与DNA修复能力受损和基因组不稳定相关。 |
| 参考文献 |
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