mTOR Antibody [L10A18]

目录号: F2516

抗体应用：反应性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: MCF7, Lane 2: HepG2, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 - 1:5000 IP1:50 - 1:100 IHC1:400

抗体应用
WB, IP, IHC

反应性
Mouse, Rat, Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
289 kDa 250 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Human breast carcinoma; Human heart; Rat testis; Rat brain; Mouse testis; Mouse brain; Mouse heart; Mouse thymus; Mouse lung; HeLa cell; A549 cell; HepG2 cell; HEK-293 cell; MCF7 cell; HaCaT cell; MDA-MB-231 cell
阴性对照	Human fetal lung; Rat heart; Rat liver; Rat spleen; Rat thymus; Rat lung; Mouse kidney; Mouse liver

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

IHC
实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IHC

实验步骤：

脱蜡/补液

1. 脱蜡/水合切片：

2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。

3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。

4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。

5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。

5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。

6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。

7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。

9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。

11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。

12. 将载玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用苏木精复染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。

16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
mTOR Antibody [L10A18] 可检测内源性 mTOR 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，胞质囊泡，内质网，高尔基体，溶酶体，细胞核，微粒体，线粒体

Uniprot ID
P42345

克隆号
L10A18

别名
FRAP, FRAP1, FRAP2, RAFT1, RAPT1, MTOR, Serine/threonine-protein kinase mTOR, FK506-binding protein 12-rapamycin complex-associated protein 1, FKBP12-rapamycin complex-associated protein, Mammalian target of rapamycin, Mechanistic target of rapamycin, Rapamycin and FKBP12 target 1, Rapamycin target protein 1, mTOR

背景
mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PI3K相关激酶（PIKK）家族，是两种不同复合物的催化核心：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）。mTORC1由三个必需亚基组成——mTOR、Raptor（mTOR的调节相关蛋白）和mLST8（哺乳动物致死Sec13蛋白8，也称为GβL）。细胞为了生长和增殖，必须增强蛋白质、脂质和核苷酸的合成，同时抑制自噬等分解代谢途径。mTORC1通过整合环境因素来调节合成代谢和分解代谢过程，从而协调这种平衡。mTORC1的主要作用之一是刺激蛋白质合成。它通过磷酸化两个主要的下游效应物来实现这一目标：p70 S6激酶1 (S6K1) 和 eIF4E 结合蛋白 (4EBP)。具体而言，mTORC1 磷酸化疏水基序内 Thr389 位点的 S6K1，从而实现随后由 PDK1 激活。除了蛋白质合成之外，mTORC1 还通过主动抑制自噬和其他分解代谢途径来促进细胞生长。相反，mTORC2 主要通过磷酸化 AGC 激酶家族成员（PKA、PKG 和 PKC）来调节增殖和存活。其最关键的功能是磷酸化和激活 Akt，Akt 是胰岛素/PI3K 信号传导的中心效应物。活化的 Akt 通过磷酸化和抑制关键底物（包括 FoxO1/3a 转录因子、代谢调节因子 GSK3β 和 mTORC1 上游抑制剂 TSC2）来驱动存活、生长和增殖。此外，mTORC2 激活 SGK1，另一种影响离子运输和细胞存活的 AGC 激酶。

背景

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PI3K相关激酶（PIKK）家族，是两种不同复合物的催化核心：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）。mTORC1由三个必需亚基组成——mTOR、Raptor（mTOR的调节相关蛋白）和mLST8（哺乳动物致死Sec13蛋白8，也称为GβL）。细胞为了生长和增殖，必须增强蛋白质、脂质和核苷酸的合成，同时抑制自噬等分解代谢途径。mTORC1通过整合环境因素来调节合成代谢和分解代谢过程，从而协调这种平衡。mTORC1的主要作用之一是刺激蛋白质合成。它通过磷酸化两个主要的下游效应物来实现这一目标：p70 S6激酶1 (S6K1) 和 eIF4E 结合蛋白 (4EBP)。具体而言，mTORC1 磷酸化疏水基序内 Thr389 位点的 S6K1，从而实现随后由 PDK1 激活。除了蛋白质合成之外，mTORC1 还通过主动抑制自噬和其他分解代谢途径来促进细胞生长。相反，mTORC2 主要通过磷酸化 AGC 激酶家族成员（PKA、PKG 和 PKC）来调节增殖和存活。其最关键的功能是磷酸化和激活 Akt，Akt 是胰岛素/PI3K 信号传导的中心效应物。活化的 Akt 通过磷酸化和抑制关键底物（包括 FoxO1/3a 转录因子、代谢调节因子 GSK3β 和 mTORC1 上游抑制剂 TSC2）来驱动存活、生长和增殖。此外，mTORC2 激活 SGK1，另一种影响离子运输和细胞存活的 AGC 激酶。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28283069/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%