NEK6 Antibody (Rabbit mAb) [P9K17]
目录号: F3641
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: Hela, Lane 3: 293T, Lane 4: HT1080
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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36 kDa
36 kDa,53 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HeLa cells; HepG2 cells; 293T cells; HT1080 cells; HepG2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| NEK6 Antibody (Rabbit mAb) [P9K17] 可检测内源性 NEK6 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，微管 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9HC98 |
| 克隆号 |
|---|
| P9K17 |
| 别名 |
|---|
| Serine/threonine-protein kinase Nek6 | Never in mitosis A-related kinase 6 | Protein kinase SID6-1512 | NimA-related protein kinase 6 | NEK6 |
| 背景 |
|---|
| NIMA相关激酶6 (NEK6) 是NIMA家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在有丝分裂细胞周期调控中发挥作用。它对于细胞进入中期、染色体正确分离、纺锤体稳定形成以及胞质分裂的完成至关重要。该激酶具有一个主要呈球状的催化结构域，以及一个短的、构象灵活的N端延伸，缺乏大型的辅助调控结构域。NEK6以单体酶的形式存在，其核心活性依赖于上游激活激酶，而非稳定的多蛋白复合物。NEK6的激活发生在NEK9的下游，NEK9本身通过CDK1和PLK1依赖性磷酸化而被激活，随后NEK9在特定的丝氨酸残基上磷酸化NEK6，从而建立起一个NEK9-NEK6激酶级联反应。该级联反应在G2/M期发挥作用，促进细胞进入有丝分裂并完成有丝分裂。 NEK6 可磷酸化多种参与纺锤体动力学和染色体运动的底物，包括驱动蛋白 KIF11/EG5 和 β-微管蛋白。这些磷酸化事件支持双极纺锤体的组装和维持，以及高效的染色体排列。该激酶还靶向调控蛋白和染色质相关蛋白，例如组蛋白 H1 和 H3、转录调控因子以及与翻译调控相关的因子，从而将其活性整合到更广泛的基因表达调控和细胞周期相关转录程序中。NEK6 参与 DNA 损伤反应，促进基因毒性应激后的 G2/M 期阻滞。在这些条件下，NEK6 活性的抑制或丧失与有丝分裂失败和细胞凋亡相关，表明 NEK6 活性对于细胞分裂检查点控制下的细胞存活至关重要。 NEK6在多种人类癌症中表达升高，其活性与p53依赖性衰老的抑制相关，表明该激酶与促进细胞持续增殖和抵抗生长停滞的致癌通路有关。在不同的肿瘤类型中，NEK6的表达与PI3K-Akt通路、细胞周期进程和肌动蛋白细胞骨架调控等通路相关，且NEK6高表达的肿瘤表现出与增强的有丝分裂活性以及细胞黏附和迁移改变相一致的转录特征。 |
| 参考文献 |
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