Nicastrin Antibody [D2C5]
目录号: F4676
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: COS-7, Lane 3: C6, Lane 4: PC12
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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110 kDa, 120 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; COS-7 cells; C6 cells; PC-12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Nicastrin Antibody [D2C5] 可检测内源性 Nicastrin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 胞质囊泡，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q92542 |
| 克隆号 |
|---|
| D2C5 |
| 别名 |
|---|
| Nicastrin; NCSTN |
| 背景 |
|---|
| 尼卡斯特林是γ-分泌酶蛋白酶复合物的关键糖蛋白亚基，与早老素、APH-1和PEN-2共同作用，在胞外结构域脱落后，能够对I型跨膜底物进行膜内蛋白水解。尼卡斯特林具有一个大的、高度糖基化的胞外结构域，该结构域包含一个底物结合口袋，其两侧由一个C端跨膜螺旋连接，该螺旋将复合物锚定在脂筏中。此外，DYIGS基序中保守的谷氨酸和酪氨酸残基排列成一个亲水性裂隙，该裂隙能够识别被切割底物的游离N端。 Nicastrin胞外结构域直接捕获由α-或β-分泌酶切割APP和Notch产生的新生氨基末端，并通过构象稳定作用将这些底物募集到活性位点。这种构象稳定作用使膜残基定位，从而通过两个并列的跨膜天冬氨酸残基介导早老素的内蛋白水解。这种对接机制具有底物选择性，破坏结合口袋的突变会差异性地损害Aβ40和Aβ42的产生或Notch胞内结构域的释放。Nicastrin的稳定作用通过亚复合物的形成阻止APH-1和全长早老素的降解，而亚复合物的形成对于从高尔基体到质膜的运输至关重要。复合物的成熟需要Nicastrin天冬酰胺的顺序糖基化，这些糖基化在组装过程中屏蔽疏水表面，最终导致PEN-2诱导的早老素内蛋白水解，从而激活催化核心。 Nicastrin通过Notch信号通路协调神经元分化，并通过调控ErbB4和钙黏蛋白的膜内蛋白水解来调节突触可塑性，其普遍表达确保了在不同组织中广泛的底物谱。家族性突变导致的失调会升高阿尔茨海默病中的Aβ42/40比值，同时破坏发育过程中的Notch信号通路模式。 |
| 参考文献 |
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