O-linked N-acetylglucosamine/O-GlcNAc Antibody (Mouse mAb) [B1J22]
目录号: F0926
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: HCT116
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
|---|
| Chemical |
| 抗体类型 |
|---|
| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 阳性对照 | Mouse cortical brain |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| O-linked N-acetylglucosamine/O-GlcNAc Antibody (Mouse mAb) [B1J22] 可检测内源性 O-linked N-acetylglucosamine/O-GlcNAc 总蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| B1J22 |
| 背景 |
|---|
| O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）是一种动态的单糖修饰，由O-GlcNAc转移酶（OGT）催化添加到核蛋白、胞质蛋白和线粒体蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基上，并由O-GlcNAc酶（OGA）去除，形成一个双酶循环。该循环通过己糖胺生物合成途径和UDP-GlcNAc的可用性与细胞营养状态紧密偶联。这种修饰发生在数百至数千种调控蛋白上，包括转录因子、激酶、磷酸酶、染色质重塑因子、细胞骨架成分和代谢酶。O-GlcNAc修饰通常与磷酸化靶向的丝氨酸/苏氨酸残基共享或相邻，形成相互或协同的O-GlcNAc-磷酸“开关”，从而响应葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和应激信号来调节蛋白质活性、亚细胞定位和相互作用网络。在信号通路中，O-GlcNAc糖基化修饰能够调节关键节点，包括胰岛素通路中的一些组分。例如，IRS-1和Akt上O-GlcNAc水平升高会干扰它们的磷酸化，从而减弱下游胰岛素信号传导，并将慢性营养过剩和己糖胺通路通量增加与胰岛素抵抗和2型糖尿病表型联系起来。在转录和表观遗传调控方面，O-GlcNAc糖基化修饰与启动子和增强子处的染色质结合，并修饰组蛋白和转录调节因子，从而将营养信号整合到基因表达程序的调控中，进而影响细胞生长、应激反应和分化。在神经生物学中，神经元蛋白广泛的O-GlcNAc糖基化修饰参与突触功能和蛋白质稳态的维持。由局部葡萄糖代谢减退引起的脑内O-GlcNAc水平降低与tau蛋白和其他阿尔茨海默病相关蛋白的磷酸化增加和聚集倾向相关。药理学方法提高tau蛋白上的O-GlcNAc修饰水平可降低其在疾病相关位点的磷酸化水平，并改变其在实验系统中的聚集特性，这表明O-GlcNAc循环是代谢与神经退行性疾病之间的机制联系。O-GlcNAc糖基化异常与糖尿病及其并发症、心血管功能障碍、癌症和神经退行性疾病密切相关。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
