Orexin Antibody (Rabbit mAb) [F2B23]
目录号: F6741
抗体应用：
反应性：
-
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded mouse brain tissue with F6741 at 1:100 dilution.
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| IHC, IF |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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13 kDa
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| 阳性对照 | Human brain; Rat brain; Mouse hypothalamus |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Orexin Antibody (Rabbit mAb) [F2B23] 可检测内源性 Orexin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 胞质囊泡，内质网，突触 |
| Uniprot ID |
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| O43612 |
| 克隆号 |
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| F2B23 |
| 别名 |
|---|
| HCRT; Hcrt1; Hcrt2; hypocretin; hypocretin (orexin) neuropeptide; Hypocretin-1; Hypocretin-2; NRCLP1; OREX; Orexin; Orexin-A; Orexin-B; OX; PPORX; PPOX; prepro-orexin |
| 背景 |
|---|
| 食欲素（下丘脑泌素）是指一小类下丘脑神经肽，它们由单一前体（前食欲素原）经蛋白水解加工而成，生成食欲素A和食欲素B。食欲素A和食欲素B作为高亲和力配体，与两种视紫红质样G蛋白偶联受体OX1R和OX2R结合，从而协调觉醒、能量平衡和动机行为。食欲素神经元聚集在下丘脑外侧区和后部，并向脑干和前脑发出密集投射，包括单胺能和胆碱能觉醒核团、皮层、边缘系统和自主神经中枢，形成一个广泛分布的输出网络。通过该网络，食欲素肽能够激活去甲肾上腺素能、多巴胺能、组胺能和胆碱能系统，从而持续稳定觉醒状态并调节阶段性觉醒。在结构和受体水平上，食欲素 A 和食欲素 B 共享 N 端区域和 C 端酰胺化，但在长度和二硫键方面有所不同，这些特征会影响受体选择性，OX1R 表现出对食欲素 A 的偏好，而 OX2R 对两种肽的结合则更为均衡；两种受体均以细胞类型依赖的方式与 Gq、Gi/o 和 Gs 家族进行混杂偶联，并能有效激活磷脂酶级联反应（PLC、PLA2、PLD），从而导致 IP3/Ca²⁺ 动员、二酰甘油和花生四烯酸的产生，在某些情况下，还会导致二酰甘油脂肪酶介导的内源性大麻素 2-花生四烯酸甘油酯的合成，进而反馈到 CB1 受体。在中枢神经元中，这些信号事件汇聚于离子通道和交换器，抑制钾离子泄漏电流并激活钠钙交换器和非选择性阳离子通道，从而产生强烈的去极化和放电频率增加。这种机制是食欲素介导的促醒核团、下丘脑摄食回路和奖赏通路兴奋的基础。食欲素神经元整合与能量状态（葡萄糖、瘦素、胃饥饿素）、昼夜节律和应激相关的多种传入信号，并据此调节肽类物质的分泌；食欲素信号增强促进觉醒、身体活动和觅食行为，而食欲素或OX2R功能丧失则会导致人类和动物模型出现猝倒性发作性睡病，这表明食欲素水平与睡眠-觉醒周期的稳定性直接相关。除了睡眠和摄食之外，食欲素能投射至海马、杏仁核和前额叶皮层，调节突触可塑性和记忆过程。受体特异性药理学和定位研究表明，OX1R通路在焦虑、疼痛调节和药物奖赏中发挥重要作用，而OX2R对非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠的调节尤为关键，因此受体亚型的激活是功能输出的重要决定因素。食欲素信号传导失调与多种疾病相关：发作性睡病中食欲素神经元的缺乏或自身免疫性丢失；肥胖、成瘾、抑郁症和神经退行性疾病中食欲素及其受体表达模式的改变；以及某些癌症中食欲素受体的异常活性，在这些癌症中，食欲素可以诱导caspase依赖性细胞凋亡。 |
| 参考文献 |
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