Osteopontin Antibody (Rabbit mAb) [K22J24]
目录号: F2207
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: NCI-H460
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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35 kDa
45 kDa, 60-65 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human urine; Human liver tissue; Human fetal kidney tissue; Human kidney tissue; A549 cells; NCI-H460 cells; NCI-H1299 cells; HepG2 cells (BFA, 300ng/ml, 3 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | HepG2 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Osteopontin Antibody (Rabbit mAb) [K22J24] 可检测内源性 Osteopontin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| P10451 |
| 克隆号 |
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| K22J24 |
| 别名 |
|---|
| BNSP, OPN, PSEC0156, SPP1, Osteopontin, Bone sialoprotein 1, Nephropontin, Secreted phosphoprotein 1, Urinary stone protein, Uropontin, SPP-1 |
| 背景 |
|---|
| 骨桥蛋白（Osteopontin），又称OPN或分泌型磷蛋白1（SPP1），是一种分泌型、高度磷酸化的酸性糖磷蛋白，属于SIBLING家族。它定位于矿化的细胞外基质和体液中，并在骨骼和免疫组织中作为基质-细胞调节因子，参与结构基质与细胞信号传导的界面调控。该蛋白包含一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素结合基序、与羟基磷灰石相互作用的多聚天冬氨酸片段、多个磷酸化和糖基化位点以及CD44结合序列；这些结构元件使骨桥蛋白能够结合αvβ3和其他整合素、CD44亚型以及矿化表面，从而将细胞与细胞外基质连接起来，同时调节细胞内信号传导。在骨骼中，骨桥蛋白富集于骨胶质线和骨吸收表面。其RGD基序与破骨细胞上的αvβ3整合素结合，促进细胞黏附、肌动蛋白环的组织和骨吸收活性；同时，其酸性钙结合区域与羟基磷灰石相互作用，参与晶体生长和矿化过程的调控，从而决定关节骨和松质骨的力学性能和重塑能力。作为一种免疫调节细胞因子样因子，骨桥蛋白由活化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞产生，并通过促进巨噬细胞和T细胞的募集、增强其存活以及调节IL-12、IL-10、IFN-γ和其他炎症介质的产生，影响Th1/Th17型免疫反应，进而塑造关节、血管和中枢神经系统等组织中的慢性炎症环境。骨桥蛋白通过整合素和CD44发出信号，激活包括PI3K-Akt和NF-κB在内的细胞内信号通路；这些受体的激活导致Akt磷酸化、IKK激活、IκBα降解、NF-κB核转位，以及尿激酶型纤溶酶原激活剂和基质金属蛋白酶相关程序的上调，从而增强癌细胞的运动性、侵袭性和存活率。在乳腺癌异种移植瘤中，分泌的骨桥蛋白调控VEGF、PDGF、IL-10、GM-CSF、细胞凋亡和增殖通路中的一系列基因，这表明骨桥蛋白通过受体介导的信号传导而非单纯的结构性基质功能，在控制血管生成、免疫调节和局部肿瘤进展中发挥作用。在骨代谢和骨骼疾病中，骨桥蛋白的表达与骨重塑、骨折修复和正畸牙齿移动密切相关；富含骨桥蛋白的基质在骨质疏松症和骨关节炎中表现出吸收和矿化特征的改变。在动脉粥样硬化斑块、类风湿性关节和多种肿瘤中均可检测到高水平的骨桥蛋白，其结合整合素/CD44、矿物质亲和力和细胞因子样信号传导特性使其与血管钙化、慢性滑膜炎、纤维化和转移微环境相关。 |
| 参考文献 |
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