OTUB1 Antibody (Rabbit mAb) [N21M4]
目录号: F7166
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HEK293T, Lane 2: HEK293T (KO OTUB1), Lane 3: U-2 OS, Lane 4: Mouse brain
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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31 kDa
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| 阳性对照 | Mouse liver tissue; Mouse brain tissue; Rat liver tissue; Rat brain tissue; HEK293T cells; HeLa cells; MCF7 cells; U-2 OS cells; C6 cells; RAW264.7 cells; PC-12 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| OTUB1 Antibody (Rabbit mAb) [N21M4] 可检测内源性 OTUB1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质 |
| Uniprot ID |
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| Q96FW1 |
| 克隆号 |
|---|
| N21M4 |
| 别名 |
|---|
| OTB1, OTU1, HSPC263, OTUB1, Ubiquitin thioesterase OTUB1, Deubiquitinating enzyme OTUB1, OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1, Otubain-1, Ubiquitin-specific-processing protease OTUB1, hOTU1 |
| 背景 |
|---|
| OTUB1 是一种 OTU 家族的去泛素化酶，它通过直接切割泛素链和非催化性阻断泛素转移来调控蛋白质泛素化，从而在调节蛋白质稳定性和多种受体下游的信号输出方面发挥核心作用。该蛋白包含一个 OTU 催化结构域，其保守的半胱氨酸-组氨酸活性位点能够水解 K48 和 K63 连接的泛素链；此外，其侧翼的 N 端和 C 端区域能够与 E2 酶和泛素复合物结合，使 OTUB1 能够在决定催化或非催化作用模式之前感知泛素连接类型和相互作用伙伴。 OTUB1通过特定的界面与泛素化的E2结合酶（例如UBE2N/UBE2D）结合，当与邻近的泛素结合时，OTUB1可以变构抑制进一步的泛素转移，而无需促进泛素链的断裂。因此，OTUB1可以通过在特定的信号节点上关闭E2活性来稳定底物。这种非经典抑制在c-IAP1和TNF受体信号通路中尤为显著。在这些通路中，OTUB1限制了K63泛素化和线性泛素化事件，否则这些事件会促进TAK1、IKK复合物的募集以及下游NF-κB的激活，从而抑制炎症和生存信号传导，并调节促凋亡和抗凋亡信号之间的平衡。 OTUB1还能去除DNA损伤反应调节因子的泛素化修饰或保护这些因子，包括泛素依赖性ATM/ATR网络中的因子，使其成为检查点控制、修复复合物组装以及基因毒性应激恢复的调节因子。OTUB1是一种经常上调的去泛素化酶，它通过阻止蛋白酶体降解来稳定致癌或促生存底物，并通过调节EMT相关转录因子和细胞骨架调节因子来支持上皮-间质转化（EMT）和细胞迁移，并通过在特定肿瘤环境中维持检查点蛋白和免疫逃逸蛋白（如PD-L1）的水平来促进耐药性。OTUB1还具有淀粉样蛋白生成特性，能够形成有序聚集体，并且它通过控制泛素周转来维持蛋白质稳态，这使其与决定神经元对错误折叠蛋白和应激的易感性的通路相关联。 |
| 参考文献 |
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