p38β/MAPK11 + p38α/MAPK14 Antibody (Rabbit mAb) [M11B5]
目录号: F9010
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: Jurkat, Lane 4: K562
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
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| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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41 kDa
124 kDa, 42 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human skin carcinoma tissue; Recombinant Human p38 alpha/MAPK14 protein; Recombinant Human p38 beta/MAPK11 protein (His tag N-Terminus); HAP1 cells; HeLa cells; Jurkat cells; K562 cells; MCF-7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Recombinant Human p38γ/MAPK12 protein (His tag N-Terminus); Recombinant Human p38δ/MAPK13 protein (His tag N-Terminus) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| p38β/MAPK11 + p38α/MAPK14 Antibody (Rabbit mAb) [M11B5] 可检测内源性 p38β/MAPK11 + p38α/MAPK14 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q16539, Q15759 |
| 克隆号 |
|---|
| M11B5 |
| 别名 |
|---|
| CSBP, CSBP1, CSBP2, CSPB1, MXI2, SAPK2A, MAPK14, SAPK2a, PRKM11, SAPK2, SAPK2B, MAPK11, MAP kinase 11, MAPK 11, p38-2, MAP kinase p38 beta, p38b, SAPK2b |
| 背景 |
|---|
| p38α (MAPK14) 和 p38β (MAPK11) 是 MAPK 家族中 p38 丝裂原活化蛋白激酶亚家族的密切相关成员，它们共享保守的双叶丝氨酸/苏氨酸激酶折叠，其激活环包含 Thr-Gly-Tyr 双磷酸化基序，并作为应激反应激酶，整合来自上游 MAP3K 和 MAP2K 的信号，从而调控免疫、炎症和癌症中的转录程序。p38α 和 p38β 的催化核心高度相似，但激活环、对接表面和 C 端尾部的细微差异赋予了它们亚型特异性的底物偏好和调控相互作用。p38α 通常含量更高，表达更广泛，而 p38β 在女性组织特异性癌症和其他情况下表现出独特的表达模式，其水平相对于正常组织可能降低。在细胞因子、Toll样受体激动剂、细菌抗原或其他应激源的刺激下，上游MAP2K MKK3/MKK6磷酸化p38α和p38β，使这些激酶能够磷酸化一系列底物，包括转录因子（ATF2、CREB、MEF2）、染色质调节因子（MSK1/2）和其他信号蛋白。对31种癌症类型的生物信息学相互作用组分析表明，p38通路的激活与细胞生长、分化、凋亡和应激反应的调控密切相关，通路激活水平与肿瘤进展和治疗反应均相关。在巨噬细胞和其他免疫细胞中，p38 活性通过至少两种机制调节 NF-κB 依赖性炎症基因表达：p38 依赖性组蛋白 H3 在特定细胞因子和趋化因子基因启动子处的磷酸化和磷酸乙酰化增加了隐蔽 κB 位点的可及性并增强了 NF-κB 的募集；p38-MSK1 信号传导可以磷酸化 RelA (p65) 以增强 NF-κB 转录激活和肿瘤坏死因子产生，从而响应细菌抗原。使用选择性抑制剂 SB203580 对 p38 进行药理学抑制，可减弱肺泡上皮模型中脂多糖诱导的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的释放，而不会阻断 NF-κB 的核转位，这表明 p38α/β 是 NF-κB 下游或平行于炎症细胞因子完全表达所必需的。新月体肾小球肾炎的组织研究表明，磷酸化的 p38 MAPK 和活化的 NF-κB 在新月体病变和肾小管上皮中共定位，与趋化因子 (MIP-1α) 水平和炎症浸润相关，并在糖皮质激素诱导的恢复期减少，这表明 p38-NF-κB 的交叉对话与人类炎症性肾脏疾病直接相关。在癌症中，基于相互作用组的分析表明，p38α、p38β、p38γ 和 p38δ 通路激活具有肿瘤类型特异性的预后意义：p38 通路高激活与星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胸腺瘤、肾癌、膀胱癌、食管癌、结直肠癌、胃癌和肺鳞状细胞癌的生存率低相关，但与 HER2 阳性和管腔型乳腺癌、前列腺癌、肉瘤和肺腺癌的预后较好相关；乳腺癌中 p38β 和 p38γ 的激活与对紫杉烷类和蒽环类药物的积极反应相关，而较低的 p38α/β 激活预示着结直肠癌对 5-氟尿嘧啶的更好反应，这突出表明 p38α/β 信号状态可以作为治疗分层和选择性 p38 抑制剂使用的功能性生物标志物。 |
| 参考文献 |
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