p57 Kip2 Antibody (Mouse mAb) [B21E12]
目录号: F7318
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SH-SY5Y
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 90s 以上。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 90s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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32 kDa
~57 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human colon carcinoma; Jurkat cells; SH-SY5Y cells; Neuro-2a cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| p57 Kip2 Antibody (Mouse mAb) [B21E12] 可检测内源性 p57 Kip2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P49918 |
| 克隆号 |
|---|
| B21E12 |
| 别名 |
|---|
| Beckwith Wiedemann syndrome (WBS); Cyclin-dependent kinase inhibitor p57; IMAGE; p57 Kip2; p57Kip2; AL024410; BWCR; BWS; CDKI; CDKN1C; KIP2; p57; p57(kip2); p57Kip2; WBS |
| 背景 |
|---|
| p57 Kip2 (CDKN1C) 与 p21 和 p27 同属 Cip/Kip 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族，它是一种强效的细胞增殖负调控因子，由位于 11p15.5 染色体上的母系表达印记基因编码，该基因位于一个生长控制域内，该域在印记障碍和癌症中经常发生改变。该蛋白包含一个N端CDK抑制结构域，该结构域在Cip/Kip家族成员中高度保守，并能结合G1期细胞周期蛋白-CDK复合物，包括细胞周期蛋白D/CDK4-6和细胞周期蛋白E/CDK2，从而导致G1期阻滞。其后是一个独特的富含脯氨酸的中央区域，该区域与LIM激酶LIMK1相互作用；以及一个C端QT结构域，该结构域与JNK/SAPK结合并抑制其活性。这些结构共同构成了一个模块化结构，将经典的细胞周期抑制与细胞骨架动力学和应激激活激酶信号的直接调控相结合。LIMK1结合的中央区域将LIMK1定位于细胞核内，并调控cofilin的磷酸化和肌动蛋白丝的组织，从而将p57 Kip2与细胞形态、迁移和神经元突起生长等调控功能联系起来，此外，它还参与细胞增殖调控。 QT结构域与JNK/SAPK结合并抑制其激酶活性，从而影响应激和发育信号下游的细胞凋亡和分化程序。同时，p57 Kip2还通过与转录调节因子和染色质相关复合物的相互作用，更广泛地调节基因组表达，从而提供了一种将CDK抑制与谱系特异性转录输出整合的途径。其表达受到严格的发育调控，且远比其他Cip/Kip蛋白更为局限，在胎盘、发育中的大脑、肌肉和造血组织中高表达，并在造血干细胞中受TGF-β/Smad等通路诱导，从而维持其静止状态；而TGF-β驱动的p57 Kip2在成骨细胞中的降解则与之相反，这表明细胞外信号的整合具有情境依赖性。蛋白质稳定性受磷酸化依赖性泛素化的调控：苏氨酸310位点的磷酸化促进SCF-Skp2 E3泛素连接酶复合物识别p57 Kip2，使其靶向蛋白酶体降解，该机制类似于Thr187依赖性p27的降解，并将p57 Kip2置于促有丝分裂CDK-Skp2通路的直接调控之下。除了在抑制G1-S期转换中发挥核心作用外，p57 Kip2在细胞和组织分化的早期阶段也扮演着关键角色，尤其是在胚胎发生、神经元发育和红细胞生成过程中，其存在协调细胞周期退出与分化表型的获得。该蛋白通过LIMK1依赖的肌动蛋白细胞骨架重组影响细胞迁移，新出现的证据表明，p57 Kip2也参与线粒体凋亡通路的调控，其特定的磷酸化模式调节其在细胞核和细胞质之间的亚细胞定位，从而改变其对细胞存活或死亡决定的影响。CDKN1C在多种上皮性和非上皮性恶性肿瘤中经常因遗传、表观遗传或印记改变而下调，这与其作为抑癌基因的分类相符。p57 Kip2的缺失或减少与增殖、侵袭和转移行为的增强相关，而过表达则在多种模型中抑制肿瘤发生特征。影响 CDKN1C 的种系功能丧失突变和表观突变会导致 Beckwith-Wiedemann 综合征，其特征是体细胞过度生长和儿童肿瘤风险升高；而不同的功能获得突变是 IMAGe 综合征的基础，其特征是严重的生长受限，这表明精细调节的 p57 Kip2 剂量对于正常的人类生长控制是必需的，而活性降低和活性过高都是致病的。 |
| 参考文献 |
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