p95/NBS1 Antibody (Rabbit mAb) [P16D23]
目录号: F4905
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Jurkat
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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84 kDa
90 kDa,95 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human testis tissue; A431 cells; HeLa cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| p95/NBS1 Antibody (Rabbit mAb) [P16D23] 可检测内源性 p95/NBS1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 染色体，细胞核，端粒 |
| Uniprot ID |
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| O60934 |
| 克隆号 |
|---|
| P16D23 |
| 别名 |
|---|
| NBS, NBS1, P95, NBN, Nibrin, Cell cycle regulatory protein p95, Nijmegen breakage syndrome protein 1, hNbs1 |
| 背景 |
|---|
| p95/NBS1（尼布林，NBN）是MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物的磷酸化蛋白组分，该复合物将DNA双链断裂（DSB）识别与ATM激活、检查点信号传导和高保真修复偶联，从而作为DNA损伤反应的关键组织者和染色体完整性的守护者。其N端区域包含一个FHA结构域，随后是串联的BRCT重复序列，这些序列可结合MDC1和γH2AX等介导蛋白上的磷酸化表位。该磷酸化识别模块对于在DSB位点募集和维持MRN复合物以及正确的G2/M检查点控制至关重要。而其C端则介导与MRE11、RAD50以及其他伙伴（包括ATM和PI3K的p110α亚基）的相互作用。 DSB形成后，NBS1通过γH2AX结合引导MRN聚集到染色质上，并将该复合物定位以刺激ATM激活；ATM在S期检查点模块中磷酸化NBS1的特定丝氨酸，而NBS1反过来通过将ATM及其底物集中在损伤焦点来放大ATM信号，从而导致下游效应因子（如CHK2、p53和SMC1）的协调磷酸化，这些效应因子在修复进行的同时，强制S期减慢、G2/M期阻滞和转录反应。 MRN-NBS1复合物还能促进DNA末端锚定、加工和同源重组，并在较小程度上调节非同源末端连接。NBS1还通过影响TRF2和ATM依赖的端粒损伤信号通路，抑制异常的染色体间重组并维持端粒稳定性。因此，NBS1缺陷会导致检查点激活受损、DSB修复缺陷、端粒侵蚀加速、端粒融合和非整倍体。NBS1可以作为生长信号的接头蛋白：其保守的C端基序可直接结合p110α的N端区域并刺激I类PI3K活性；NBS1过表达可激活PI3K-Akt信号通路并诱导细胞转化。 NBS1 失调可将 DNA 损伤通路与致癌的存活和增殖回路相偶联。NBS1 的种系功能缺失突变会导致尼梅亨断裂综合征，这是一种隐性染色体不稳定性疾病，其特征为小头畸形、生长迟缓、免疫缺陷、放射敏感性和淋巴系统恶性肿瘤高发。携带诸如 657del5 等复发性突变的杂合子携带者患乳腺癌的风险增加，这反映了 NBS1 对基因组维持的剂量依赖性需求。 |
| 参考文献 |
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