PABP1 Antibody (Mouse mAb) [G23P5]
目录号: F8813
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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71 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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PABP1 Antibody (Mouse mAb) [G23P5] 可检测内源性 PABP1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞突起，细胞质，细胞核，剪切小体 |
| Uniprot ID |
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| P11940 |
| 克隆号 |
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| G23P5 |
| 别名 |
|---|
| PAB1, PABP, PABP1, PABPC2, PABPC1, Polyadenylate-binding protein 1, PABP-1, Poly(A)-binding protein 1 |
| 背景 |
|---|
聚腺苷酸结合蛋白（PABP），以胞质亚型PABPC1为代表，属于一个保守的RNA识别基序蛋白家族。该家族蛋白能够结合真核生物mRNA的聚腺苷酸尾，并作为多功能支架参与基因表达的转录后调控，整合核内聚腺苷酸化和输出与胞质翻译、终止和mRNA稳定性。该蛋白包含一系列N端RNA识别基序，可与聚腺苷酸尾内的腺苷酸残基接触；以及一个C端PABC结构域，可与效应蛋白（如eIF4G和PAIP1/PAIP2）相互作用。这种模块化结构将RNA结合与翻译因子和调控伴侣的募集联系起来。在翻译起始阶段，PABP 与 3′ 端 poly(A) 尾结合，并与 5′ 端帽状结构的 eIF4F 复合物中的 eIF4G 相互作用，促进闭环信使核糖核蛋白结构的形成。该结构增强了核糖体的募集，支持高效的翻译再起始，并保护 mRNA 免受核酸外切酶的攻击。因此，PABP 在尾部的结合直接调控着许多转录本的翻译效率。在翻译终止阶段，PABP 与真核生物释放因子相互作用，刺激其募集和终止密码子的识别，从而稳定正确的翻译终止，减少通读现象，并有助于区分正常转录本和异常转录本，例如在无义介导的 mRNA 降解过程中。在mRNA降解途径中，PABP可以保护poly(A)尾免受去腺苷酸化作用，并抑制无义介导的mRNA降解，从而维持许多mRNA的稳定性。但在特定情况下，PABPC1会募集去腺苷酸化酶复合物，启动poly(A)尾的缩短并触发mRNA的降解。因此，PABP对单个转录本的活性取决于其与RNA结合蛋白和降解酶的相互作用。核内形式的PABP通过在多聚腺苷酸化过程中调节poly(A)尾的长度，以及促进新形成的mRNP的成熟和输出，参与poly(A)尾的合成，从而将共转录RNA加工与下游胞质调控联系起来，而这一过程是由同一蛋白家族介导的。发育研究表明，不同的PABP家族成员具有不可替代的功能：胞质PABP和胚胎PABP（EPABP）调控脊椎动物卵母细胞中的母源mRNA翻译，EPABP的缺失会导致卵母细胞成熟缺陷并伴有不孕，这表明PABP介导的poly(A)依赖性翻译的调控对于早期发育程序至关重要。在神经退行性疾病中，PABP1定位于肌萎缩侧索硬化症（ALS）中部分胞质TDP-43包涵体和应激颗粒，尤其是在C9orf72扩增的患者中，这与其作为核心应激颗粒成分的作用以及与ALS相关的RNA结合蛋白的相互作用相一致，提示运动神经元病理中以PABP为中心的mRNP组装体存在紊乱。 |
| 参考文献 |
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