PAF1 Antibody [D19B13]
目录号: F6889
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: PANC-1, Lane 3: RAW264.7, Lane 4: H-4-II-E
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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80 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells; PANC-1 cells; Raw 264.7 cells; H-4-II-E cells; COS-7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| PAF1 Antibody [D19B13] 可检测内源性 PAF1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q8N7H5 |
| 克隆号 |
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| D19B13 |
| 别名 |
|---|
| RNA polymerase II-associated factor 1 homolog; hPAF1; Pancreatic differentiation protein 2; PAF1; PD2 |
| 背景 |
|---|
| Paf1（RNA聚合酶II相关因子1）是保守的Paf1复合物（Paf1C）的核心亚基。Paf1C是一个多功能延伸相关模块，它与延伸中的RNA聚合酶II（RNAPII）机器物理结合，并作为平台协调转录、染色质修饰和RNA加工事件。Paf1复合物包含Paf1、Ctr9、Cdc73、Leo1、Rtf1，以及在高等真核生物中还包含Ski8。它与RNAPII一起穿过活跃转录的基因，在那里与Spt4-Spt5、FACT和其他延伸因子相互作用，从而影响聚合酶的持续性和染色质的完整性。 Paf1C 的一个关键机制功能是刺激组蛋白 H2B 的泛素化，进而促进组蛋白 H3 的甲基化，并调节转录区域周围的核小体动力学，从而塑造 RNA 聚合酶 II (RNAPII) 必须穿越的染色质结构。Paf1C 还通过 Cdc73 亚基募集切割和多聚腺苷酸化特异性因子 (CPSF) 和切割刺激因子 (CstF) 复合物，将转录延伸与 mRNA 3' 端加工偶联起来，确保 3' 端加工机制在基因末端进行共转录组装。此外，Paf1C 的 Ski8 亚基将该复合物与 TRAMP/Ski/外泌体 RNA 监控网络连接起来，从而实现共转录质量控制并降解异常或无功能的转录本。 |
| 参考文献 |
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