PAR2 Antibody [J17G12]
目录号: F4721
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HCT116, Lane 2: HepG2
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
32 kDa
|
| 阳性对照 | HCT 116 cells; Hep G2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| PAR2 Antibody [J17G12] 可检测内源性 PAR2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P55085 |
| 克隆号 |
|---|
| J17G12 |
| 别名 |
|---|
| Proteinase-activated receptor 2; Coagulation factor II receptor-like 1; CD142; F2RL1 |
| 背景 |
|---|
| PAR2 与 PAR1、PAR3 和 PAR4 同属蛋白酶激活受体家族，是 G 蛋白偶联受体。PAR2 的特点是其 N 端隐蔽的配体通过蛋白水解酶暴露而激活，而非通过可扩散的激动剂激活。PAR2 由七个跨膜螺旋组成，其胞外 N 端含有 SFLLRN 序列。当 SFLLRN 序列在 Arg36 位点被胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶或肥大细胞类胰蛋白酶切割后，该序列会折叠回与第二个胞外环结合，从而触发 G 蛋白解离。蛋白酶激活诱导构象转变，其中TM6向外移动暴露DRY基序，从而与Gαq/11偶联，刺激磷脂酶Cβ水解PIP2生成IP3和DAG，动员细胞内钙离子促进平滑肌收缩。同时，PKC介导的Raf-MEK-ERK级联激活驱动细胞因子转录，并通过Elk-1和NF-κB核转位发挥作用。β-arrestin-2的募集维持MAPK信号通路，并促进网格蛋白介导的内吞作用，该作用可回收功能性受体或将其靶向溶酶体降解。中性粒细胞弹性蛋白酶在不同位点的切割产生偏向性激动作用，生成G12/13-RhoA，从而促进细胞迁移而非分泌。 R36-S37位点的经典胰蛋白酶切割激活了全面的Gq/11、Gi和G12/13信号通路，而非经典位点则通过差异性β-arrestin结合产生信号偏向。PAR2通过Rac1依赖的伪足突出调控上皮屏障修复，并通过炎症期间TRPV1敏化导致感觉神经元过度兴奋，其在结肠肠细胞、气道上皮和背根神经节中的表达最高，反映了其在黏膜防御和疼痛传递中的作用。信号肽屏蔽可防止生物合成过程中过早的细胞内激活，从而确保其表面活性。PAR2的组成型上调通过诱导IL-8和MMP9，驱动结肠炎相关肿瘤发生和关节炎滑膜炎。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
