PARG Antibody [B20B2]
目录号: F7055
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: COS-7
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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130 kDa
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| 阳性对照 | HPB-ALL cells; HeLa cells; COS-7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PARG Antibody [B20B2] 可检测内源性 PARG 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q86W56 |
| 克隆号 |
|---|
| B20B2 |
| 别名 |
|---|
| Poly(ADP-ribose) glycohydrolase; PARG |
| 背景 |
|---|
| PARG是降解PARP家族成员合成的聚（ADP-核糖）链的主要酶，维持着这种关键的翻译后修饰在细胞核、细胞质和线粒体区室间的动态平衡。PARG通过选择性剪接产生多种亚型，其中较大的变体在细胞核和细胞质之间穿梭，执行内切和外切糖苷水解，从而从组蛋白和修复因子等蛋白质受体上依次释放ADP-核糖单体和较短的寡聚体，同时保留单ADP-核糖基化底物中的末端酯键。催化作用依赖于一个保守的宏结构域样折叠，该折叠可结合线性和分支的PAR链，协调镁依赖的亲核攻击以裂解α-OP糖苷键，并回收游离的ADP-核糖以补充NAD+，从而终止PARP信号传导，并使DNA损伤诱导的修饰得以快速逆转。PARG通过拆解募集XRCC1和APLF等修复复合物的PAR支架来对抗PARP1/2的过度激活，从而促进碱基切除修复和同源重组途径的进行，同时防止复制叉长时间停滞。PARG的同工型动态定位于线粒体，其中较小的变体在氧化应激期间维持PARG活性，通过清除PAR化的丙酮酸脱氢酶亚基（否则会抑制三羧酸循环的进入）来维持生物能量通量。 PARG通过调控RNA聚合酶II和染色质重塑因子上的PAR蛋白周转来协调转录调控，从而在免疫细胞分化和炎症反应过程中精细调节基因表达。PARG的缺失或抑制会导致PAR水平升高，使PARP酶滞留在损伤位点，进而通过G2/M期阻滞和有丝分裂灾难，增强DNA交联剂（如顺铂）在修复缺陷型肿瘤中的合成致死效应。 |
| 参考文献 |
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