Pax2 Antibody (Rabbit mAb) [N14F20]
目录号: F1161
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hPAX2 transfected)
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
45 kDa
|
| 阳性对照 | Human fetal kidney tissue; Human normal kidney tissue; Human renal cell carcinoma tissue; Human malignant melanoma tissue; Human kidney tissue; Human kidney cancer tissue; Mouse kidney tissue; HepG2 cells; K-562 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Pax2 Antibody (Rabbit mAb) [N14F20] 可检测内源性 Pax2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q02962 |
| 克隆号 |
|---|
| N14F20 |
| 别名 |
|---|
| Paired box protein Pax-2, PAX2 |
| 背景 |
|---|
| Pax2 是一种配对盒家族转录因子，它包含一个保守的配对 DNA 结合域和一个八肽基序，对区域性胚胎模式形成和器官发生至关重要，尤其是在中枢神经系统、肾脏和眼睛中，它通过直接调控多个发育信号级联来控制谱系特化、上皮分化和组织形态发生。该蛋白通过其配对域结合特定的富含 AT 的序列，并可根据启动子环境和辅助因子发挥转录激活或抑制作用，其表达在空间和时间上受到严格限制；在中脑-后脑区域，Pax2 是 Otx2-Gbx2 边界上最早表达的基因之一，并与 Pax5、Pax8、En1/2 以及信号分子 Wnt1 和 Fgf8 一起参与维持峡部组织者，该组织者指导中脑和小脑的发育。在肾脏发育过程中，Pax2 在肾小管以及前肾、中肾和后肾的间充质中表达，小鼠和人类的遗传证据表明，Pax2 位于控制未分化后肾间充质向肾小管上皮转变的分子级联的顶端附近；功能缺失突变体表明，Pax2 是间充质前体细胞转化为分化肾上皮细胞所必需的，而其表达在细胞退出有丝分裂周期时下调，表明其在早期肾脏发生过程中促进增殖和存活的作用，然后在终末分化过程中被沉默。 Pax2通过直接或间接调控关键效应因子整合多种发育信号通路：动物研究表明，Pax2与Gdnf、Ret、Wnt4、SHH和Fgf家族成员相互作用并调控转录网络，从而组织肾脏谱系分化、输尿管芽出现、分支形态发生和肾单位诱导；Pax2激活肝细胞生长因子（HGF）启动子并调控c-Ret表达与肾脏和前列腺的发育及肿瘤发生过程密切相关。在神经系统中，Pax2参与特定神经元和胶质细胞群的分化，包括中脑-后脑中间神经元以及视神经和视网膜胶质细胞。对禽类和哺乳动物视网膜及视神经的比较表达研究揭示了胶质细胞中存在不同的Pax2亚型，并在视神经模式形成和神经回路维持中发挥支持作用。人类生殖系PAX2基因突变会导致肾-视神经缺损综合征，其特征为肾发育不全、膀胱输尿管反流和视神经缺损，这与其在肾脏和眼睛发育中的双重作用相符。对PAX2信号通路的研究表明，PAX2单倍体不足或剂量改变会干扰形态发生素梯度和下游基因网络，从而导致肾脏和泌尿道先天性异常以及眼部畸形。相反，在囊性肾病和发育不良性肾病以及肾癌（如肾母细胞瘤、肾细胞癌和多囊肾病）中，会观察到持续或重新激活的Pax2表达。在这些疾病中，Pax2的异常表达与持续的上皮细胞增殖、抗凋亡和细胞周期失调相关，这使得Pax2成为一个有吸引力的治疗靶点，抑制Pax2可以通过阻断DNA结合来破坏Pax2介导的转录。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
