PDE4B Antibody (Rabbit mAb) [A23H17]
目录号: F5209
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A-204, Lane 2: Mouse brain, Lane 3: Rat brain
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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90 kDa
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| 阳性对照 | Mouse brain; Rat brain |
|---|---|
| 阴性对照 | A-204 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PDE4B Antibody (Rabbit mAb) [A23H17] 可检测内源性 PDE4B 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q07343 |
| 克隆号 |
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| A23H17 |
| 别名 |
|---|
| 3',5'-cyclic-AMP phosphodiesterase 4B, DPDE4, PDE32, cAMP-specific phosphodiesterase 4B, PDE4B, DPDE4 |
| 背景 |
|---|
| PDE4B是PDE4家族中一种cAMP特异性磷酸二酯酶，它能将3′,5′‐cAMP水解为AMP，并调节多种免疫细胞和神经细胞中的局部cAMP水平，使其成为cAMP依赖性信号通路的关键负调控因子。该蛋白包含I类PDE的保守催化核心，其中金属结合的His和Asp残基构成活性位点，该位点可配位二价阳离子并将cAMP定位以进行亲核攻击；其N端调控区则将PDE4B亚型靶向特定的亚细胞区室和支架复合物。在树突状细胞和单核细胞中，PDE4B是主要的cAMP降解酶，其活性限制受体刺激后cAMP的积累，从而控制PKA和EPAC依赖性磷酸化事件的幅度和持续时间，进而影响NF‐κB、CREB和其他转录因子。通过调控 cAMP 梯度，PDE4B 调节 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等炎症细胞因子的产生，影响共刺激分子的表达，并在细菌脂多糖和其他刺激的反应过程中调节促炎和抗炎程序之间的平衡。在心肌细胞中，PDE4B 定位于与 β1-肾上腺素能受体相关的肌膜区室，其催化活性构成局部负反馈环路的一部分，该环路限制 β1-肾上腺素能刺激产生的 cAMP 信号，从而调节 PKA 对附近底物的磷酸化，这些底物调控钙离子处理和收缩力。该区室中 PDE4B 的基因缺失或药理学抑制会导致 β1-肾上腺素能 cAMP 反应增强，并改变与兴奋-收缩耦联相关的蛋白质的磷酸化。 |
| 参考文献 |
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