Pericentrin Antibody (Rabbit mAb) [N1M2]
目录号: F2239
抗体应用：
反应性：
-
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human thyroid cancer tissue with F2239 at 1:2000 dilution.
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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378 kDa
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| 阳性对照 | Human breast tissue; Human thyroid carcinoma tissue; Human pancreas tissue; NIH/3T3 cells; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Pericentrin Antibody (Rabbit mAb) [N1M2] 可检测内源性 Pericentrin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，微管 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95613 |
| 克隆号 |
|---|
| N1M2 |
| 别名 |
|---|
| KIAA0402, PCNT2, PCNT, Pericentrin, Kendrin, Pericentrin-B |
| 背景 |
|---|
| 中心粒蛋白是一种大型卷曲螺旋蛋白，它在中心粒周围物质（围绕两个中心粒的蛋白质基质，这两个中心粒共同构成中心体，中心体是动物细胞的主要微管组织中心）内形成一个细长的支架。作为结构支架，中心粒蛋白锚定并募集一组特定的中心粒周围物质成分，包括 CDK5RAP2、NEDD1 和 γ-微管蛋白环状复合物，从而将这些微管成核因子定位在中心体上，而不是让它们在细胞质中自由扩散。中心粒蛋白介导的γ-微管环状复合物在有丝分裂中心体的锚定对于纺锤体的正常组织至关重要。中心粒蛋白突变体与γ-微管复合物组分GCP2和GCP3的结合能力降低，导致有丝分裂期间中心体星状体的形成显著减少，而间期星状体和Ran介导的、不依赖于中心体的星状体组装基本不受影响。这表明中心粒蛋白的锚定功能选择性地依赖于有丝分裂期间中心体依赖的微管组织，而非普遍依赖于微管成核。这种锚定机制的丧失会触发检查点反应，阻止细胞进入有丝分裂，并在多种细胞类型中诱导细胞凋亡。这表明中心粒蛋白依赖的中心体完整性与细胞周期进程直接相关，而不仅仅是与纺锤体几何结构相关。中心粒蛋白（pericentrin）的完全缺失会导致有丝分裂纺锤体紊乱和染色体分离错误；PCNT基因的双等位基因功能缺失突变会导致II型小头畸形骨发育不良原始侏儒症，该疾病的特征是严重的比例性矮小和明显的头小畸形，尽管大多数患者的智力接近正常。除了纺锤体组装外，中心粒蛋白还参与中心体相关Chk1的募集，从而将中心体的完整性与DNA损伤时的G2/M期检查点激活联系起来。该检查点通路的破坏是中心粒蛋白缺失导致原始侏儒症生长发育障碍的一种可能机制，其他机制还包括纺锤体方向直接缺陷以及干细胞分裂的不对称与对称性随机化。相反，中心粒蛋白的过表达会在成纤维细胞中产生额外的中心体和多极纺锤体，表明中心粒蛋白的缺失和过量都会破坏正常中心体的数量和功能。对中心粒蛋白剂量的双重敏感性，以及其作为支架依赖性检查点调节剂而非被动结构标记物的既定作用，使得中心粒蛋白成为研究中心体相关生长障碍以及癌症中中心体完整性和基因组稳定性之间联系的研究人员的明确靶点。 |
| 参考文献 |
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