Phospho-Akt1 (Ser473) Antibody (Rabbit mAb) [E4M2]
目录号: F0518
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: LNCaP, Lane 2: LNCaP (Calyculin A, 0.1 uM, 30 min)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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55 kDa
56kDa, 60 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | AKT1 cells; NIH/3T3 cells (PDGF, 100ng/ml, 1 h); LNCaP cells (Cacyculin A, 100nM, 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Rat heart; Mouse brain; MCF7 cells; HepG2 cells; HUVEC cells; C2C12 cells; HEK293 cells; LNCaP cells; NIH/3T3 cells; A549 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Phospho-Akt1 (Ser473) Antibody (Rabbit mAb) [E4M2] 仅识别 Ser473 处磷酸化的内源性 Akt1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P31749 |
| 克隆号 |
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| E4M2 |
| 别名 |
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| PKB, RAC, AKT1, RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, Protein kinase B, Protein kinase B alpha, Proto-oncogene c-Akt, RAC-PK-alpha, PKB alpha |
| 背景 |
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| 磷酸化Akt1 (Ser473) 是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt1/PKB的活化疏水基序形式，Akt1/PKB是I类PI3K通路的核心效应分子，调控多种哺乳动物组织中的存活、生长、代谢和细胞周期进程。Akt1蛋白包含一个N端pleckstrin同源结构域，该结构域可结合质膜上的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸；一个中央催化激酶结构域；以及一个C端调控尾部，其中Ser473是保守疏水基序的一部分。PDK1对Akt1活化环上的Thr308位点进行磷酸化，mTORC2复合物对C端尾部的Ser473位点进行磷酸化，从而产生完全活化的激酶状态，并增强其对下游底物的催化效率。磷酸化形式的Akt1（Ser473）可磷酸化Bad、FOXO转录因子、caspase-9、c-Raf、GSK3、TSC2以及mTOR-raptor复合物中的mTOR，并调控p21和p27，从而抑制促凋亡信号通路，促进细胞存活，刺激糖原合成，并支持细胞周期的启动和进程。磷酸化Akt1（Ser473）通过响应PI3K生成的磷脂酰肌醇，并将这些信号传递给代谢和生长调控效应因子（包括葡萄糖转运、糖原代谢和蛋白质合成的调节因子），参与胰岛素和生长因子信号通路。 Akt1 Ser473位点的磷酸化发生在受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体激活I类PI3K的下游，生成的磷酸化Akt1（Ser473）存在于细胞膜、细胞质和细胞核中，反映了信号传导过程中的动态重分布。PTEN通过去磷酸化PIP3来抑制Akt1的膜募集，而一些磷酸酶则直接去磷酸化Akt1，从而降低Ser473磷酸化Akt1的比例，这些磷酸酶共同参与对Akt1磷酸化状态的负调控。许多肿瘤样本显示Akt Ser473磷酸化水平升高，并以此作为通路激活的标志。然而，Thr308和Ser473磷酸化的比较分析表明，在某些癌症中，Thr308与Akt的催化活性更直接相关，但Ser473仍然是Akt通路激活的常用替代指标。 |
| 参考文献 |
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