Phospho-ALK (Tyr1282/1283) Antibody (Rabbit mAb) [K9K20]
目录号: F1494
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SUP-M2, Lane 2: SUP-M2 (CIP treated)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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176 kDa
80 kDa (NPM-ALK), 220 kDa (ALK)
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | SUP-M2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-ALK (Tyr1282/1283) Antibody (Rabbit mAb) [K9K20] 仅识别 Tyr1282/1283 处磷酸化的内源性 ALK 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UM73 |
| 克隆号 |
|---|
| K9K20 |
| 别名 |
|---|
| ALK | ALK receptor tyrosine kinase | ALK tyrosine kinase receptor | Anaplastic lymphoma kinase | anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase | CD246 | CD246 antigen | mutant anaplastic lymphoma kinase | NBLST3 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化ALK（Tyr1282/1283）表示间变性淋巴瘤激酶受体的激活状态，此时其激活环内的两个酪氨酸残基被磷酸化。这种修饰相当于致癌性NPM-ALK融合蛋白中的Tyr342/343，标志着具有催化活性的激酶能够传递增殖和存活信号。ALK激酶结构域遵循典型的受体酪氨酸激酶折叠，其激活环包含Tyr1282和Tyr1283。磷酸化蛋白质组学分析已将这些残基鉴定为关键的激活环磷酸化位点，同时还鉴定出激酶其他位置的调控位点，从而定义了一种区分非活性ALK和具有信号传导能力的ALK的磷酸化模式。配体结合或融合驱动的二聚化导致ALK在该激活环内发生自身磷酸化，其中Tyr1282/1283的磷酸化可稳定活性构象，并为下游效应分子提供对接位点；特异性识别Tyr1282/1283磷酸化ALK的抗体表明，这种磷酸化状态存在于某些癌细胞系和肿瘤中，并对应于下游通路的强烈激活。一旦Tyr1282/1283磷酸化，ALK便可通过多个信号级联传递信号，主要包括Ras-ERK/MAPK轴、PI3K-Akt通路和JAK-STAT信号通路，从而诱导支持细胞周期进程、抗凋亡程序和侵袭行为的基因表达。在神经母细胞瘤和其他ALK驱动的肿瘤中，活化的ALK能够强效磷酸化STAT3的Tyr705位点，从而将Tyr1282/1283激活环的状态与STAT3依赖的转录程序连接起来，促进肿瘤生长和抵抗应激。在NPM-ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤和EML4-ALK阳性的非小细胞肺癌中，融合介导的寡聚化维持着组成型激活环的磷酸化，产生磷酸化的ALK Tyr1282/1283，作为稳定的致癌信号，驱动PLCγ、IRS-1、Shc和PI3K的激活，并赋予这些融合蛋白促有丝分裂和促进细胞存活的表型。对邻近残基（例如ALK Y1278S）的突变分析表明，激活环区域的改变可导致ALK自身及其下游靶点的配体非依赖性磷酸化，这表明Tyr1282/1283位点的磷酸化与局部序列特征相结合，从而调节基础和诱导的激酶活性。在各种肿瘤类型中，磷酸化ALK Tyr1282/1283可作为ALK通路激活的功能性生物标志物：其检测与ALK酪氨酸激酶抑制剂的疗效相关，并有助于在泛癌分析中对ALK改变的肿瘤进行分层，从而支持其在精准肿瘤学中用于监测靶点抑制和耐药性的出现。 |
| 参考文献 |
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