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Phospho-AMPKα1 (Ser496) Antibody [K3H21]
目录号: F3294
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (LP treated), Lane 3: Hela
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
64 kDa
|
| 阳性对照 | 293T cells; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 | 293T cells (treated with LP) |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-AMPKα1 (Ser496) Antibody [K3H21] 仅识别 Ser496 处磷酸化的内源性 AMPKα1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13131 |
| 克隆号 |
|---|
| K3H21 |
| 别名 |
|---|
| AMPK1; PRKAA1; 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-1; AMPK subunit alpha-1; Acetyl-CoA carboxylase kinase; Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase kinase; Tau-protein kinase PRKAA1; ACACA kinase; HMGCR kinase |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化AMPKα1（Ser496）是AMP激活蛋白激酶（AMPK）α1催化亚基C端调控结构域内的一种抑制性磷酸化事件。AMPK是一种关键的异源三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，它通过监测AMP/ATP比值来感知细胞能量应激。AMPK的激活需要激活环中Thr172的磷酸化，而Ser496的磷酸化发生在一个灵活的自身抑制片段中，与激酶结构域的保守结构不同。这种修饰主要在肾上腺素能或cAMP水平升高的情况下由PKA诱导，在渗透压应激的情况下由PKD或CKI诱导。它通过削弱α和β亚基之间的界面，从空间上破坏异源三聚体的组装，阻碍上游激酶接近Thr172，从而即使在能量耗竭信号存在的情况下也能减弱AMPK的活性。 Ser496磷酸化会损害核转位并降低底物结合，导致ACC等关键靶点的磷酸化水平降低，从而抑制脂肪酸氧化。阻止Ser496磷酸化的突变会增强Thr172磷酸化和AMPK活性，并在脂肪分解应激下改善胰岛素敏感性；而持续的Ser496磷酸化则会通过阻断AMPK介导的葡萄糖摄取和自噬，导致代谢综合征中持续性高血糖。Ser496磷酸化通过抑制细胞抑制性AMPK反应，帮助肿瘤细胞在营养匮乏的情况下存活。 |
| 参考文献 |
|---|
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