Phospho-AMPKα2 (Ser491) Antibody (Rabbit mAb) [J2M12]
目录号: F5719
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HEK-293, Lane 2: HEK-293 (λ Phosphatase, 1 h)
操作要点
WB
建议曝光 120s 以上。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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62 kDa
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| 阳性对照 | HEK-293 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-AMPKα2 (Ser491) Antibody (Rabbit mAb) [J2M12] 仅识别 Ser491 处磷酸化的内源性 AMPKα2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P54646 |
| 克隆号 |
|---|
| J2M12 |
| 别名 |
|---|
| AMPK, AMPK2, PRKAA2, 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2, AMPK subunit alpha-2, Acetyl-CoA carboxylase kinase, Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase kinase, ACACA kinase, HMGCR kinase |
| 背景 |
|---|
| AMPKα2属于AMP激活蛋白激酶（AMPK）的催化α亚基家族，AMPK是一种异源三聚体能量感应复合物。Ser491位于α亚基C端结构域富含丝氨酸/苏氨酸的调控环内，对应于AMPKα1中的Ser487位点。多个上游激酶汇聚于该单个残基，通过一种不同于LKB1介导的经典Thr172激活环磷酸化的机制来抑制AMPK活性。在骨骼肌细胞中，蛋白激酶D1直接磷酸化AMPKα2的Ser491位点，该磷酸化事件抑制AMPK活性并损害下游胰岛素信号传导，从而确立了PKD1作为直接负调控因子，在脂质过量条件下将二酰甘油反应信号传导与AMPK抑制联系起来。在下丘脑中，位于PI3K-Akt-mTOR轴下游的p70S6激酶响应瘦素刺激，特异性地磷酸化AMPKα2的Ser491位点。这种磷酸化作用会降低AMPK活性，且与Thr172位点的磷酸化无关，表明Ser491修饰在机制上独立于主要的激活开关。这种p70S6K介导的Ser491位点磷酸化是瘦素抑制食物摄入的厌食作用所必需的，从而将AMPKα2上的单个磷酸化事件与生理摄食行为直接联系起来。值得注意的是，Akt 本身在胰岛素或 IGF-1 的作用下会磷酸化 AMPKα1 的 Ser487 位点，但 AMPKα2 的 Ser491 位点相对而言不太容易被 Akt 直接磷酸化，这意味着胰岛素驱动的 AMPKα2 活性抑制是通过 p70S6K 等间接或替代激酶进行的，而不是通过 Akt 直接作用于该位点进行的。尽管两种 α 亚型的序列位置几乎相同，但这种区别却区分了它们的调控逻辑。由于该调控环的磷酸化会阻止上游激酶随后接近 Thr172 激活位点，因此 Ser491 磷酸化起到抑制开关的作用，可以微调 AMPKα2 在特定代谢状态下的激活程度，使该磷酸化事件成为胰岛素、瘦素和二酰甘油反应通路汇聚到能量感知机制上的活性负反馈信号的标志，这在研究胰岛素抵抗和食欲调节受损的骨骼肌和下丘脑组织中尤为重要。 |
| 参考文献 |
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