Phospho-ATM (Ser1981) Antibody [A4J11]
目录号: F4167
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293 (UV, 4 h), Lane 2: 293
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议曝光 120s 以上。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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350 kDa
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| 阳性对照 | 293 cells (UV, 100 mJ, 4 h) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-ATM (Ser1981) Antibody [A4J11] 仅识别 Ser1981 处磷酸化的内源性 ATM 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，胞质囊泡，细胞骨架，细胞核，过氧化物酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13315 |
| 克隆号 |
|---|
| A4J11 |
| 别名 |
|---|
| Serine-protein kinase ATM; Ataxia telangiectasia mutated (A-T mutated); ATM |
| 背景 |
|---|
| 丝氨酸1981位点的磷酸化ATM（ATM S1981ph）是共济失调毛细血管扩张突变激酶（ATM）的典型激活标志。ATM是一种核心的磷脂酰肌醇3激酶相关激酶，在PIKK信号通路中协调细胞对DNA双链断裂的反应。在没有损伤的情况下，非活性ATM主要以二聚体形式存在，并保持闭合构象。但当双链断裂发生时，MRE11-RAD50-NBS1（MRN）传感器复合物会将ATM募集到损伤位点，并促进二聚体乙酰化依赖性解离，从而使Ser1981位点发生反式自磷酸化。这种磷酸化稳定了活性单体形式，并通过与MDC1等介质的相互作用，增强其在断裂位点的滞留。 ATM蛋白在Ser1981位点磷酸化后，会通过磷酸化众多下游效应分子（包括Ser139位的组蛋白H2AX、CHK2、p53、BRCA1以及DNA修复检查点相关蛋白）来启动强大的信号级联反应，从而将DSB检测与细胞周期阻滞、DNA修复以及（当损伤严重时）细胞衰老或凋亡联系起来。这些ATM蛋白S1981磷酸化依赖的信号与平行的ATR和DNA PKcs通路整合，协调多种细胞类型中的G2/M期检查点执行、同源重组、非同源末端连接和转录反应，使得磷酸化ATM蛋白Ser1981成为实验系统中广泛应用的基因毒性应激和DNA损伤信号通路的检测指标。在毛细血管扩张性共济失调中，ATM 功能的丧失会消除 Ser1981 磷酸化并破坏 DSB 诱导的检查点激活，导致极度放射敏感性、神经退行性变和癌症风险增加，因此 ATM S1981ph 依赖的信号传导最终在遗传性 DNA 修复缺陷和各种易患癌症的情况下都会失调。 |
| 参考文献 |
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