Phospho-Bad (Ser112) Antibody [F3L12]

目录号: F3347

抗体应用：反应性：Rat, Human

Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (Calyculin A, 100 ng/ml, 30 min )

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。

使用信息

稀释比例
WB1:5000 IP1:30

抗体应用
WB, IP

反应性
Rat, Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
18 kDa 23 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HeLa cells (Calyculin A, 100 ng/ml, 30 min); C6 cells (Calcyculin A treated)
阴性对照	C6 cells; HeLa cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-Bad (Ser112) Antibody [F3L12] 仅识别 Ser112 处磷酸化的内源性 Bad 蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内膜系统，线粒体，线粒体外膜

Uniprot ID
Q92934

克隆号
F3L12

别名
BBC6; BCL2L8; BAD; Bcl2-associated agonist of cell death; Bcl-2-binding component 6; Bcl-2-like protein 8; Bcl-xL/Bcl-2-associated death promoter; Bcl2 antagonist of cell death; Bcl2-L-8

背景
磷酸化 Bad Ser112 指的是 Bad 蛋白上的丝氨酸 112 磷酸化位点。Bad 蛋白是 Bcl-2 家族中一个由 184 个氨基酸组成的促凋亡 BH3 结构域成员，它通过其跨越 103 至 127 位残基的 α 螺旋 BH3 结构域与抗凋亡的 Bcl-2 和 Bcl-xL 形成异二聚体。其中，关键残基 Leu107、Asp112 和 Leu118 对于插入 Bcl-xL 结合槽并置换 Bax 或 Bak 以触发线粒体外膜通透性和细胞凋亡至关重要。 Ser112位于BH3两亲性螺旋的N端，处于一个柔性环中。该位点的磷酸化会诱导构象变化，从而暴露14-3-3磷酸结合基序，特别是残基112至117处的I型RSXpSXP基序；当Ser136也被磷酸化时，还会暴露残基136至141处的II型RXYpSXP基序。这种修饰破坏了BH3螺旋的两亲性，抑制了其与Bcl-xL的结合，反而促进了14-3-3蛋白将Bad隔离在胞质中。 Ser112磷酸化介导对IL-3或EGF等生长因子的存活信号传导，这些生长因子激活Ras/Raf-MAPK/ERK-p90RSK通路或线粒体锚定PKA，导致Bad磷酸化并被隔离在14-3-3复合物中，从而阻断其促凋亡活性，促进细胞存活和增殖。PP2A介导的去磷酸化，尤其是在存活信号撤离时，会破坏14-3-3复合物的结合，并与Ser136（由Akt介导）和Ser155（由PKA介导）的磷酸化丧失共同作用，释放Bad以拮抗Bcl-xL或Bcl-2并促进细胞凋亡。这种调控机制将细胞因子和PI3K非依赖性的MAPK通路与线粒体凋亡调节器联系起来，对淋巴细胞和生长因子依赖性细胞存活尤为重要。由致癌 Ras 或 MAPK 通路介导的 Bad 过度磷酸化会导致白血病和癌等癌症产生治疗耐药性，而 PP2A 的重新激活可以使肿瘤重新对细胞凋亡敏感。

背景

磷酸化 Bad Ser112 指的是 Bad 蛋白上的丝氨酸 112 磷酸化位点。Bad 蛋白是 Bcl-2 家族中一个由 184 个氨基酸组成的促凋亡 BH3 结构域成员，它通过其跨越 103 至 127 位残基的 α 螺旋 BH3 结构域与抗凋亡的 Bcl-2 和 Bcl-xL 形成异二聚体。其中，关键残基 Leu107、Asp112 和 Leu118 对于插入 Bcl-xL 结合槽并置换 Bax 或 Bak 以触发线粒体外膜通透性和细胞凋亡至关重要。 Ser112位于BH3两亲性螺旋的N端，处于一个柔性环中。该位点的磷酸化会诱导构象变化，从而暴露14-3-3磷酸结合基序，特别是残基112至117处的I型RSXpSXP基序；当Ser136也被磷酸化时，还会暴露残基136至141处的II型RXYpSXP基序。这种修饰破坏了BH3螺旋的两亲性，抑制了其与Bcl-xL的结合，反而促进了14-3-3蛋白将Bad隔离在胞质中。 Ser112磷酸化介导对IL-3或EGF等生长因子的存活信号传导，这些生长因子激活Ras/Raf-MAPK/ERK-p90RSK通路或线粒体锚定PKA，导致Bad磷酸化并被隔离在14-3-3复合物中，从而阻断其促凋亡活性，促进细胞存活和增殖。PP2A介导的去磷酸化，尤其是在存活信号撤离时，会破坏14-3-3复合物的结合，并与Ser136（由Akt介导）和Ser155（由PKA介导）的磷酸化丧失共同作用，释放Bad以拮抗Bcl-xL或Bcl-2并促进细胞凋亡。这种调控机制将细胞因子和PI3K非依赖性的MAPK通路与线粒体凋亡调节器联系起来，对淋巴细胞和生长因子依赖性细胞存活尤为重要。由致癌 Ras 或 MAPK 通路介导的 Bad 过度磷酸化会导致白血病和癌等癌症产生治疗耐药性，而 PP2A 的重新激活可以使肿瘤重新对细胞凋亡敏感。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12944463/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10597268/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%