Phospho-Bad (Ser136) Antibody [K15E21]

目录号: F0394

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Monkey

Lane 1: ACHN, Lane 2: ACHN (hEGF, 100 ng/ml, 30 min), Lane 3: C2C12, Lane 4: C2C12 (insulin, 100 nM，30 min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
23 kDa

阳性对照	ACHN cell (Human Epidermal Growth Factor, 100 ng/ml, 30 min); C2C12 cell (insulin, 100 nM, 30 min); COS-7 cell (treated with Human Epidermal Growth Factor for 100 ng/ml, 30 min)
阴性对照	ACHN cell; C2C12 cell

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-Bad (Ser136) Antibody [K15E21] 仅识别 Ser136 处磷酸化的内源性 Bad 蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内膜系统，线粒体，线粒体外膜

Uniprot ID
Q92934

克隆号
K15E21

别名
Bcl2-associated agonist of cell death; BAD; Bcl-2-binding component 6; Bcl-2-like protein 8 (Bcl2-L-8); Bcl-xL/Bcl-2-associated death promoter; Bcl2 antagonist of cell death; BAD; BBC6; BCL2L8

背景
磷酸化Bad（Ser136）是Bcl-2家族BH3结构域亚家族中的促凋亡成员，它通过其中央BH3结构域与Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白结合，从而调节线粒体外膜通透性和细胞凋亡。位于该结构域附近的Ser136位点（相当于人Bad蛋白的Ser99）的磷酸化会通过构象变化破坏这种相互作用，并促进14-3-3蛋白将其隔离到胞质中，从而抑制Bad的促凋亡活性，并使Bcl-2/Bcl-xL能够阻止Bax/Bak的激活和细胞色素c的释放。这种磷酸化是由 PI3K 下游的 Akt/PKB 等生存激酶以及通过 Rho GTP 酶的 PAK1 介导的，是促进细胞存活的关键机制，尤其是在癌症中，磷酸化 Bad (Ser136) 水平升高与生长因子依赖性肿瘤中致癌信号增强和对细胞凋亡的抵抗有关，这些肿瘤的存活依赖于生长因子信号。

背景

磷酸化Bad（Ser136）是Bcl-2家族BH3结构域亚家族中的促凋亡成员，它通过其中央BH3结构域与Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白结合，从而调节线粒体外膜通透性和细胞凋亡。位于该结构域附近的Ser136位点（相当于人Bad蛋白的Ser99）的磷酸化会通过构象变化破坏这种相互作用，并促进14-3-3蛋白将其隔离到胞质中，从而抑制Bad的促凋亡活性，并使Bcl-2/Bcl-xL能够阻止Bax/Bak的激活和细胞色素c的释放。这种磷酸化是由 PI3K 下游的 Akt/PKB 等生存激酶以及通过 Rho GTP 酶的 PAK1 介导的，是促进细胞存活的关键机制，尤其是在癌症中，磷酸化 Bad (Ser136) 水平升高与生长因子依赖性肿瘤中致癌信号增强和对细胞凋亡的抵抗有关，这些肿瘤的存活依赖于生长因子信号。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9346240/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10837473/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%