Phospho-β-Catenin (Ser33) Antibody (Rabbit mAb) [M22A24]
目录号: F5139
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (Calyculin A, 100nM, 30 min)
操作要点
WB
建议曝光 120s 以上。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM, ELISA |
| 反应性 |
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| Mouse, Human, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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85 kDa
90 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | PC-3 cells (treated with Calyculin A) |
|---|---|
| 阴性对照 | PC-3 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-β-Catenin (Ser33) Antibody (Rabbit mAb) [M22A24] 仅识别 Ser33 处磷酸化的内源性 β-Catenin 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，细胞突起，细胞质，细胞骨架，内膜系统，细胞核，突触 |
| Uniprot ID |
|---|
| P35222 |
| 克隆号 |
|---|
| M22A24 |
| 别名 |
|---|
| Catenin beta-1, Beta-catenin, CTNNB1, CTNNB |
| 背景 |
|---|
| β-catenin是经典Wnt信号通路的核心效应分子，它既能通过与α-catenin和E-cadherin相互作用构成黏附连接的结构成分，又能作为转录共激活因子释放到细胞质和细胞核中。Ser33位点的磷酸化会标记该蛋白的降解，从而控制其发挥上述两种作用中的哪一种。在没有Wnt配体的情况下，胞质β-catenin会被降解复合物捕获。该复合物是由Axin作为中心支架的多蛋白组装体，可直接结合APC、酪蛋白激酶1α、GSK3以及β-catenin自身。Axin是限速因子，其自身聚合对于β-catenin有效募集到该复合物中至关重要。在磷酸化反应进行之前，α-catenin 必须首先与 β-catenin 解离。这一过程由 Src 家族激酶 FER 和 FYN 介导的 Tyr142 位点酪氨酸磷酸化触发，从而使酪蛋白激酶 1α 能够接触到其底物。酪蛋白激酶 1α 随后磷酸化 β-catenin 的 Ser45 位点，这一修饰形成了一个启动位点，该位点对于 GSK3 依次磷酸化更靠近 N 端的残基 Thr41、Ser37 和 Ser33 是必要且充分的，最终生成一个磷酸化残基簇，统称为磷酸降解子。 APC与磷酸化和非磷酸化β-catenin结合的晶体结构显示，APC自身内部的CK1和GSK3底物序列发生相互启动磷酸化，生成一个磷酸化依赖性结合基序，该基序增强APC对β-catenin的亲和力，并在磷酸化循环中稳定降解复合物。一旦Ser33和Ser37被磷酸化，这两个残基共同构成F-box蛋白β-TrCP的识别位点。β-TrCP是SCF泛素连接酶复合物的底物识别亚基，其结合触发β-catenin的多聚泛素化，使其靶向蛋白酶体降解，从而在静息状态下维持胞质β-catenin的低水平。完整的人类降解复合物的重建证实，复合物结合的β-catenin亚群在CK1靶向的Ser45位点和GSK3靶向的Ser33、Ser37和Thr41位点均具有真实的磷酸化修饰，从而在纯化的生化系统中验证了顺序启动机制。Ser33、Ser37或Thr41位点的突变会阻止这种磷酸化依赖性的降解循环，使β-catenin蛋白在不依赖于上游Wnt信号的情况下保持稳定。此类突变在肿瘤细胞系中反复出现，因此Ser33磷酸化的缺失可作为降解复合物功能障碍和癌症中Wnt通路异常激活的明确分子标志。 |
| 参考文献 |
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