Phospho-Bim (Ser69) Antibody (Rabbit mAb) [C24C5]
目录号: F0796
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji, Lane 2: Raji (TPA-treated for 30 min)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
22 kDa
|
| 阳性对照 | Raji cells (TPA-treated for 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Raji cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Bim (Ser69) Antibody (Rabbit mAb) [C24C5] 仅识别 Ser69 处磷酸化的内源性 Bim 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内膜系统，线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| O43521 |
| 克隆号 |
|---|
| C24C5 |
| 别名 |
|---|
| B2L11; BAM; bcl-2 interacting mediator of cell death; BCL2 like 11; Bcl2-interacting mediator of cell death; Bcl2-L-11; BCL2L11; BIM; BIM-alpha6; BIM-beta6; BIM-beta7; BimEL; BimL; BOD |
| 背景 |
|---|
| Bim是Bcl-2家族中一种仅含BH3结构域的促凋亡蛋白，它拮抗促生存的Bcl-2蛋白并促进线粒体凋亡。BimEL剪接变体包含一个N端调控区，其中人类的Ser69（小鼠和大鼠的Ser65）是一个关键的磷酸化位点，它通过ERK1/2 MAPK通路整合生存信号。BimEL携带一个BH3结构域，该结构域介导其与抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1）的高亲和力结合；其相邻的C端疏水区段支持其线粒体定位；而Ser69附近的N端区域包含一个ERK结合位点和一个磷酸化降解子，该降解子控制蛋白质周转，而非直接与Bcl-2家族靶蛋白结合。生长因子或佛波酯刺激激活ERK1/2，导致BimEL在Ser69位点直接磷酸化，该残基是ERK介导修饰的必要且充分条件；磷酸化BimEL（Ser69）以迁移速度较慢的形式积累，随后快速发生多聚泛素化和蛋白酶体依赖性降解，从而降低BimEL的稳态浓度，并在生长因子撤离后通常有利于细胞凋亡的情况下，使细胞存活的平衡发生转变。ERK1/2通路的激活是驱动BimEL磷酸化和加速周转的必要且充分条件。蛋白酶体抑制或泛素激活酶E1的破坏会阻断这种降解，而BimEL的Ser69突变为甘氨酸的突变体能够抵抗ERK诱导的丢失，并且比野生型BimEL表现出更强的凋亡活性，这表明Ser69位点在促有丝分裂条件下作为关键开关，控制着Bim依赖性死亡信号的强度。Ser69的磷酸化与ERK最小反应区域中其他邻近的磷酸化位点协同作用，该区域能够募集泛素化机制。这种修饰还能促进BimEL与抗凋亡伴侣（如Mcl-1和Bcl-xL）的解离，使BimEL暴露于βTrCP和相关的E3连接酶复合物的识别之下，这些复合物催化多聚泛素化和随后的蛋白酶体加工。因此，磷酸化Bim（Ser69）状态在功能上标记BimEL，使其从线粒体死亡复合物和细胞中移除。在信号网络层面，磷酸化Bim（Ser69）作为受体酪氨酸激酶、BCR-ABL或其他维持MAPK信号通路的致癌驱动因子下游ERK1/2活性的读数；生存因子通路利用此机制维持BimEL的低水平，而ERK1/2的抑制、上游激酶（如MEK）的阻断或致癌驱动因子的中断会导致Ser69磷酸化丧失、未磷酸化BimEL的积累、caspase激活和细胞凋亡的执行。ERK-磷酸化Bim（Ser69）轴对于控制成纤维细胞和上皮细胞在血清或细胞因子撤离期间的细胞凋亡至关重要，在淋巴组织中，它有助于抗原或细胞因子信号与Bim依赖性细胞死亡之间的偶联，尽管其他机制也可以在体内维持Bim的功能。在疾病环境中，许多具有组成型 ERK 激活的癌症通过增强 Ser69 磷酸化和降解而表现出 BimEL 蛋白减少，而减弱 MAPK 信号的靶向治疗通常可以恢复 BimEL 并触发细胞凋亡，因此磷酸化 Bim (Ser69) 被广泛用作机制生物标志物，以监测 ERK 通路活性、Bim 调节以及在激酶抑制剂或应激反应中存活和内在凋亡之间的平衡。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
