Phospho-BTK (Tyr551) Antibody (Rabbit mAb) [D4E1]
目录号: F3973
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Ramos (pervanadate, 1mM, 30 min), Lane 2: K-562 (pervanadate, 1mM, 30 min), Lane 3: Ramos (pervanadate, 1mM, 30 min; Alkaline Phosphatase, 1 h)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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76 kDa
75 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse embryonic 14.5 tissue; Rat embryonic 14.5 t tissue |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-BTK (Tyr551) Antibody (Rabbit mAb) [D4E1] 仅识别 Tyr551 处磷酸化的内源性 BTK 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q06187 |
| 克隆号 |
|---|
| D4E1 |
| 别名 |
|---|
| AGMX1, ATK, BPK, BTK, Tyrosine-protein kinase BTK, Agammaglobulinemia tyrosine kinase, B-cell progenitor kinase, Bruton tyrosine kinase |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化BTK（Tyr551）是指布鲁顿酪氨酸激酶在其C端激酶结构域的激活环酪氨酸残基上发生磷酸化修饰。这种修饰标志着抗原和固有免疫受体下游的催化激活，并将BTK定位为B细胞和其他造血谱系中的中心信号节点。BTK属于Tec家族，其N端包含一个pleckstrin同源结构域，该结构域可结合磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯（PI3P），随后是Tec同源区、介导蛋白质-蛋白质相互作用的SH3和SH2结构域，以及一个C端激酶结构域，该结构域的激活环包含关键调控残基Tyr551。 B细胞受体或其他免疫受体的激活导致PI3K依赖性的PIP3生成，BTK通过其PH结构域募集至细胞膜，并使Tyr551暴露于Src家族激酶Lyn和Syk，后者对Tyr551进行反式磷酸化，从而诱导活性酪氨酸激酶特有的构象重排。Tyr551的磷酸化增强了BTK的催化活性，并促进SH3结构域中Tyr223的有效自磷酸化，从而稳定开放的、完全活性的酶构象。该酶构象通过磷酸化PLCγ2等底物来传递B细胞受体信号，并促进下游Ca²⁺动员、PKC激活、NF-κB和MAPK通路激活，以及B细胞活化、存活和分化的转录程序。 Tyr551 的突变会消除 BCR 诱导的钙离子内流，而 Tyr223 的突变则不会，这表明 Tyr551 的磷酸化是功能性 BCR 信号传导的主要决定因素。生化分析表明，激活环的磷酸化直接调节激酶动力学和底物识别。仅在 Tyr551 磷酸化时识别 BTK 的磷酸化特异性抗体表明，BCR 交联或 TLR4 刺激后 Tyr551 的磷酸化迅速增加，并且与膜定位的、具有信号传导能力的 BTK 相关。而 PKCβ 介导的 Ser180 磷酸化会降低 PH 结构域依赖的膜募集，从而限制 Tyr551 的跨磷酸化，为 BTK 激活设定一个负反馈阈值。Tyr551 位点调控的 BTK 活性对于正常的 B 细胞发育至关重要。 BTK 的种系功能丧失会导致 X 连锁无丙种球蛋白血症，并阻碍前 B 细胞的成熟；而异常或组成性 BTK 激活则有助于慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤等疾病中恶性 B 细胞的存活和增殖，其中 Tyr551 磷酸化提供了通路激活和对共价和非共价 BTK 抑制剂的药效学反应的机制读数。 |
| 参考文献 |
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