Phospho-c-Myc (Thr58) Antibody (Rabbit mAb) [G15N9]
目录号: F6672
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: EL4, Lane 2: EL4 (MG-132, 10 μM, 18 h)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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50 kDa
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| 阳性对照 | HDLM-2 cells (MG-132, 10 μM, 18 h); Daudi cells (MG-132, 10 μM, 18h); EL4 cells (MG-132, 10 μM, 18h) |
|---|---|
| 阴性对照 | EL4 cells; Raji cells; HDLM-2 cells (MG-132, 10 μM, 18 h; GSK-3 Inhibitor XXII, Compound A, 5 μM, 18 h) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-c-Myc (Thr58) Antibody (Rabbit mAb) [G15N9] 仅识别 Thr58 处磷酸化的内源性 c-Myc 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 染色体，细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P01106 |
| 克隆号 |
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| G15N9 |
| 别名 |
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| avian myelocytomatosis viral oncogene homolog; BHLHE39; c-Myc; MRTL; MYC; Myc proto-oncogene protein; v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog; v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) |
| 背景 |
|---|
| c-Myc蛋白第58位苏氨酸（Thr58）的磷酸化是其稳定性、亚核定位和致癌活性的关键调控修饰。该转录因子属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-ZIP）家族，可与Max蛋白形成异二聚体，调控控制细胞生长、增殖、分化和凋亡的基因。Thr58位于N端转录激活结构域内，是伯基特淋巴瘤和其他侵袭性人类淋巴瘤的突变热点，该位点的突变会消除磷酸化依赖性蛋白水解，从而增强致癌转化。糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 是介导 Thr58 磷酸化的主要激酶，它通过直接结合细胞核内的 c-Myc 发挥作用。GSK-3α 和 GSK-3β 两种亚型均能磷酸化 Thr58，并促进 c-Myc 的泛素化和蛋白酶体降解。该磷酸化过程遵循一定的顺序机制：有丝分裂信号、有丝分裂进程或细胞应激首先诱导 ERK、CDK 或 JNK 等激酶在丝氨酸 62 (Ser62) 位点发生磷酸化。Ser62 的磷酸化作为一种启动修饰，使后续的 GSK-3 介导的 Thr58 磷酸化成为可能，但 GSK-3 与 c-Myc 的结合与 Ser62 的磷酸化状态无关。 Thr58磷酸化触发E3泛素连接酶SCF^Fbw7^的募集，该酶识别磷酸化的降解基序，介导多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而限制c-Myc蛋白的稳定性并抑制其致癌潜能。该修饰改变了c-Myc的亚核分布，使其与GSK-3一起定位于特定的核体，这些核体可能代表活跃的蛋白水解位点或远离染色质相关转录复合物的隔离位点。锂处理抑制GSK-3活性，特异性地阻止Thr58磷酸化并增加c-Myc蛋白的稳定性，而不影响Ser62磷酸化，表明GSK-3对Thr58位点具有选择性调控作用。与野生型c-Myc相比，T58A磷酸化缺陷突变体表现出显著增强的蛋白稳定性。转基因表达c-Myc(T58A)可导致乳腺密度增加、增生灶增多、细胞发育不良以及乳腺癌，并伴有基因组不稳定性增加和细胞凋亡抑制。而S62A突变体则降低乳腺密度并表现出正常的细胞凋亡功能，这表明这些磷酸化位点具有不同的调控作用。人类癌症中Thr58与Ser62磷酸化比例发生改变，永生化细胞中Thr58磷酸化水平低于原代细胞，导致c-Myc蛋白水平升高，从而驱动增殖信号传导并绕过正常的生长限制。 Thr58 的磷酸化状态整合了来自生长因子通路（包括诱导 Ser62 启动磷酸化的 Ras/MAPK 级联反应）和 GSK-3 的信号。GSK-3 本身响应 PI3K/AKT 信号通路，其中 AKT 介导的 GSK-3 抑制通过阻止 Thr58 磷酸化来稳定 c-Myc，从而形成一个将生长因子受体激活与 c-Myc 蛋白丰度联系起来的调控回路。缺乏包含 Thr58 的 N 端结构域的 c-MycS 亚型无法与 GSK-3 结合，并逃脱磷酸化依赖性降解，这表明激酶识别需要特定的结构。Thr58 的磷酸化协调 c-Myc 的降解与细胞周期进程，使得 c-Myc 在 G1/S 期转换期间能够短暂积累以促进细胞增殖，同时确保随后的降解以允许细胞退出有丝分裂并防止基因组过度不稳定。 |
| 参考文献 |
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