Phospho-Cyclin B1 (Ser133) Antibody (Rabbit mAb) [K22L23]
目录号: F5804
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela (hydroxyurea, 24 h), Lane 2: Hela (nocodazole, 24 h)
操作要点
WB
建议曝光 60s 以上。
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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55 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells (nocodazole, 24 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells (hydroxyurea, 24 h) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Cyclin B1 (Ser133) Antibody (Rabbit mAb) [K22L23] 仅识别 Ser133 处磷酸化的内源性 Cyclin B1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P14635 |
| 克隆号 |
|---|
| K22L23 |
| 别名 |
|---|
| CCNB, CCNB1, cyclin B1, G2/mitotic-specific cyclin B1, G2/mitotic-specific cyclin-B1 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化细胞周期蛋白B1 (Ser133) 代表细胞周期蛋白B1在丝氨酸残基133位点的活性磷酸化形式。该磷酸化修饰位于细胞质滞留信号域内，是控制有丝分裂过程中CDK1/细胞周期蛋白B1复合物进入细胞核的关键调控修饰。细胞周期蛋白B1属于B型细胞周期蛋白家族，它与CDK1结合形成促有丝分裂因子，该因子是真核细胞中驱动G2期向M期转换的主要调控因子。该蛋白包含一个N端细胞质滞留信号域，其中包含五个磷酸化位点；以及一个C端细胞周期蛋白盒结构域，该结构域直接与CDK1结合。在细胞分裂前期，Polo样激酶1优先磷酸化细胞周期蛋白B1的Ser133位点，产生一个核输入信号，使CDK1/细胞周期蛋白B1复合物能够从细胞质快速转位到细胞核内。这种核输入是启动细胞有丝分裂的关键开关。核内 CDK1/细胞周期蛋白 B1 复合物磷酸化组蛋白 H3、核纤层蛋白和微管相关蛋白，从而触发染色体凝缩、核膜破裂和纺锤体组装。细胞周期蛋白 B1 在 G2 期逐渐积累，并在后期开始时被后期促进复合物/Cdc20 介导的泛素化降解。丝裂原活化蛋白激酶和 CDK1 自身也会磷酸化胞质滞留信号中的 Ser116、Ser126 和 Ser128 位点，与 Ser133 位点的磷酸化协同作用，确保细胞周期蛋白 B1 完全进入细胞核。Polo 样激酶 1 对 Ser133 位点的磷酸化具有优先性，优于其他胞质滞留信号位点。Ser133 位点的磷酸化直接控制细胞核输入速率，而不影响 CDK1 的结合亲和力或激酶活性。细胞周期蛋白B1过早地在细胞核内积累与恶性细胞的染色体不稳定性相关。细胞周期蛋白B1的过表达常见于乳腺癌、前列腺腺癌和非小细胞肺癌组织中。 |
| 参考文献 |
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