Phospho-EGF Receptor (Tyr998) Antibody (Rabbit mAb) [L7A22]
目录号: F1409
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A431, Lane 2: A431 (EGF treated)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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175 kDa
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| 阳性对照 | BxPC-3 cells (EGF treated); A431 cells (hEGF, 100 ng/mL, 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | A431 cells; BxPC-3 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-EGF Receptor (Tyr998) Antibody (Rabbit mAb) [L7A22] 仅识别 Tyr998 处磷酸化的内源性 EGF Receptor 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内质网，内体，高尔基体，内膜系统，细胞核，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P00533 |
| 克隆号 |
|---|
| L7A22 |
| 别名 |
|---|
| Epidermal growth factor receptor, Proto-oncogene c-ErbB-1, Receptor tyrosine-protein kinase erbB-1, EGFR, ERBB, ERBB1, HER1 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化EGF受体（Tyr998）代表EGFR的一种配体诱导的调控状态，其中位于近膜/近端胞质区的一个酪氨酸残基以延迟动力学被磷酸化，主要参与受体内吞和转运的调控，而非经典的Ras-ERK信号通路起始。该受体本身是一种HER/ErbB家族I型跨膜激酶，具有胞外配体结合胞外结构域、单次跨膜螺旋、胞内酪氨酸激酶结构域以及包含多个典型自磷酸化位点和丝氨酸/苏氨酸簇的C端尾部；Tyr998位于这些主要对接酪氨酸残基的N端，并与附近的Ser991一起被磷酸化，构成一个独特的多位点磷酸化盒。对EGF刺激的癌细胞进行定量磷酸化蛋白质组学分析表明，Tyr998和Ser991位点的磷酸化积累速度慢于Tyr1068和Tyr1173等经典信号位点。携带Y998F或S991A突变的受体仍保持强大的ERK激活能力，并维持EGF刺激的GRB2结合能力，表明Tyr998对于近端Ras-ERK信号通路并非必需，但参与了后续的调控阶段。Tyr998和Ser991对于高效的网格蛋白介导的内吞作用具有特异性：尽管激酶激活正常，但Y998F和S991A受体的内吞作用受损，EGFR与E3连接酶CBL的结合减少，受体泛素化水平降低，这些因素共同导致受体进入降解途径的延迟。转运缺陷的Y998F和S991A受体在下游丝氨酸/苏氨酸簇Ser1039和Thr1041位点表现出磷酸化水平升高。这些残基受p38 MAP激酶调控，此前已被证实参与应激诱导的内吞和再循环。p38的药理学抑制可降低Ser1039/Thr1041的磷酸化水平并改变受体转运动力学，这表明存在一个协调的磷酸化网络，其中Tyr998和Ser991“授权”后续的p38依赖性修饰，从而精细调控内吞和再循环。在该模型中，Tyr998磷酸化作为时空编码的一部分，将经典停泊位点的早期自磷酸化模式与后续CBL、泛素化机制和p38调控的转运因子的募集联系起来，从而在EGF刺激下维持持续的表面信号传导和受体下调之间的平衡。 |
| 参考文献 |
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