Phospho-eIF4G (Ser1108) Antibody (Rabbit mAb) [G15K10]
目录号: F4969
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A431, Lane 2: SK-Br-3, Lane 3: MCF-7
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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175 kDa
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| 阳性对照 | Human ovary cancer tissue; A431 cells; SK-Br-3 cells; MCF-7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-eIF4G (Ser1108) Antibody (Rabbit mAb) [G15K10] 仅识别 Ser1108 处磷酸化的内源性 eIF4G 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q04637 |
| 克隆号 |
|---|
| G15K10 |
| 别名 |
|---|
| Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1, eIF-4-gamma 1; eIF-4G 1; eIF-4G1, p220, EIF4G1, EIF4F, EIF4G, EIF4GI |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化eIF4G（Ser1108）对应于真核起始因子4G支架蛋白的一种血清调控、mTOR敏感的磷酸化状态。该支架蛋白在eIF4F复合物中发挥作用，协调mRNA帽识别、RNA解旋酶活性以及mRNA募集至核糖体，并将生长因子和营养信号整合到翻译起始的选择性调控中。eIF4G1蛋白包含多个模块化区域，这些区域可结合mRNA帽上的eIF4E、eIF4A解旋酶、eIF3和40S核糖体亚基，以及4E-BP等调控因子；其C端区域包含多个血清刺激的磷酸化位点，包括Ser1108，这些位点响应上游激酶级联反应。胰岛素样生长因子1等配体激活PI3K-mTOR通路后，Ser1108位点的磷酸化水平升高，而PI3K抑制剂LY294002和mTOR/FRAP抑制剂雷帕霉素均可阻断该磷酸化，表明该位点直接受经典生长和营养感知通路调控，这些通路也调控p70S6K和4E-BP的磷酸化。Ser1108位点的磷酸化与eIF4E-eIF4G相互作用增强和帽依赖性翻译的激活相关，并且该位点的磷酸化程度与活性eIF4F复合物的组装以及依赖于高效帽识别和5'UTR解旋的生长相关mRNA的翻译状态相关。 MNK2是一种与MAPK相互作用的激酶，可被ERK和p38 MAPK激活。它通过一条负调控通路限制eIF4G Ser1108的磷酸化，该通路影响mTOR信号通路：MNK2的缺失会增加Ser1108的磷酸化水平，并且在雷帕霉素治疗、饥饿或肌肉萎缩等条件下维持这种修饰；而MNK2的过表达则会降低Ser1108的磷酸化水平并减少p70S6K的激活。这种关系表明MNK2是mTOR依赖性eIF4G激活的抑制因子，磷酸化eIF4G（Ser1108）是MAPK-MNK2和PI3K-mTOR通路在骨骼肌和其他胰岛素反应组织中精细调控翻译能力的关键节点。含有 Ser1108 的同一 C 端片段还整合了额外的调节磷酸化，从而产生组合修饰模式，调节 eIF4A 和 eIF4B 的结合、eIF4F 的稳定性以及募集结构化或弱翻译 mRNA 的效率，这使得磷酸化 eIF4G (Ser1108) 与合成代谢条件下起始复合物组成的更广泛重塑联系起来。 |
| 参考文献 |
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