Phospho-Elk-1 (Ser383) Antibody (Mouse mAb) [P22B17]
目录号: F0798
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Non-phosphorylated Elk-1 fusion protein expressed in E. coli, Lane 2: Erk2-phosphorylated Elk-1 fusion protein expressed in E. coli
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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45 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Elk-1 (Ser383) Antibody (Mouse mAb) [P22B17] 仅识别 Ser383 处磷酸化的内源性 Elk-1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P19419 |
| 克隆号 |
|---|
| P22B17 |
| 别名 |
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| ETS domain-containing protein Elk-1, ELK1 |
| 背景 |
|---|
| Ser383位点的磷酸化Elk-1标志着ETS结构域转录因子Elk-1的激活形式。Elk-1是一种三元复合物因子，它与血清反应因子（SRF）结合，从而激活早期基因启动子中的血清反应元件（SRE）。Elk-1具有N端ETS DNA结合结构域、SRF相互作用的B-box结构域以及富含丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点的C端转录激活结构域。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），特别是ERK1/2，能够磷酸化该结构域内的Ser383及其相邻的Ser389位点，其中Ser383是ERK特异性和转录增强的主要位点。这种磷酸化通过C端区域和p300的N端增强了Elk-1与p300之间已存在的相互作用，同时生成新的结合界面，募集p300的组蛋白乙酰转移酶活性，从而参与染色质重塑和SRE驱动的基因激活，例如c-fos。JNK/SAPK也靶向Ser383，驱动应激反应性转录，而CAMK4、p38和PAK1在不同的刺激下发挥作用。磷酸化的Ser383-Elk-1在有丝分裂中期至末期定位于纺锤体极，与Aurora-A激酶相互作用以促进极定位，然后在胞质分裂过程中转移到中体；Aurora抑制剂会破坏这种定位，使其保留在DNA上。Ser383磷酸化将生长因子/应激信号与快速的早期基因诱导偶联，从而支持细胞增殖、存活和细胞周期进程。失调与脑肿瘤有关，其中磷酸化 Elk-1 升高与侵袭性增殖相关；也与阿尔茨海默病有关，其中抑制可改善病理。 |
| 参考文献 |
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