Phospho-FoxM1 (Thr600) Antibody (Rabbit mAb) [A10D13]
目录号: F1412
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (Nocodazole, 100 ng/ml, 24 h)
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
84 kDa
|
| 阳性对照 | HeLa cells (synchronized in mitosis with Nocodazole, 100 ng/ml, 16 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-FoxM1 (Thr600) Antibody (Rabbit mAb) [A10D13] 仅识别 Thr600 处磷酸化的内源性 FoxM1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q08050 |
| 克隆号 |
|---|
| A10D13 |
| 别名 |
|---|
| FKHL16; forkhead box M1; forkhead box M1-D; Forkhead box protein M1; FOXM1; FOXM1A; FOXM1B; FOXM1C; HFH-11; HFH11; HNF-3; MPP2; PIG29; TGT3; Transcription factor Trident; TRIDENT; WIN |
| 背景 |
|---|
| Thr600位点的磷酸化FoxM1代表有丝分裂相关的激活形式，即Forkhead box M1转录因子。Forkhead box M1是forkhead家族成员，控制着多种细胞周期基因的表达，这些基因对于DNA复制、G2/M期转换和有序的有丝分裂进程至关重要。FoxM1包含一个N端转录激活和调控区，该区域具有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点；一个位于细胞中央的forkhead DNA结合域，该域识别细胞周期基因启动子中的共有序列；以及一个C端转录激活域，该域募集共激活因子。在Thr600、Thr611和Thr620等位点，细胞周期蛋白/Cdk复合物的协同磷酸化，以及其他激酶的参与，使得FoxM1在S期晚期和G2/M期从非活性状态转变为具有转录活性的状态。 Thr600 位于转录激活区域的 Cdk 共识基序内，突变和相互作用分析表明，Thr600 和 Thr611 的磷酸化增强了 FoxM1 与细胞周期磷酸酶 CDC25A 的结合，稳定了这种相互作用，并促进了 CDC25A 依赖的抑制性 Cdk 残基的去磷酸化，从而形成了一个正反馈回路，其中 FoxM1 激活和 Thr600 磷酸化增强了 Cdk1/细胞周期蛋白 B 的激活，并驱动细胞进入有丝分裂。这种磷酸化状态受细胞周期调控，FoxM1蛋白水平在G1/S期开始升高，Thr600磷酸化的FoxM1在S/G2期晚期积累，此时正值FoxM1转位至细胞核以及CCNB1、PLK1、CDC25B、Aurora B和survivin等启动子转录活性达到峰值之前。这些启动子共同调控中心体成熟、纺锤体形成、染色体分离和胞质分裂。磷酸化特异性抗体和HTRF检测试剂盒仅识别Thr600位点磷酸化的FoxM1，这些工具表明Thr600磷酸化与有丝分裂起始紧密相关，并在增殖细胞和肿瘤细胞中升高。这些工具被广泛用作FoxM1通路激活的生物标志物，并用于筛选抑制Thr600磷酸化和下调FoxM1靶基因的小分子FoxM1抑制剂。对 FoxM1 在癌症中的生物学特性的研究表明，FOXM1 在许多人类肿瘤中过度表达和过度激活，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌，并通过在磷酸化 FoxM1 的控制下维持 G2/M 调节因子、DNA 修复因子和干性相关基因的表达，导致多种恶性肿瘤特征，如不受控制的增殖、基因组不稳定、上皮-间质转化、转移、治疗耐药性和逃避抗肿瘤免疫。 Thr600磷酸化的FoxM1水平高与侵袭性临床病理特征和不良预后相关，实验性FoxM1抑制剂可降低Thr600磷酸化并干扰FoxM1–CDC25A和FoxM1–PLK1回路，从而抑制肿瘤异种移植生长并降低FoxM1调控的有丝分裂基因的表达，这支持将磷酸化FoxM1 Thr600用作靶向药物作用的机制读数和候选治疗生物标志物。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
