Phospho-GEF-H1 (Ser886) Antibody (Rabbit mAb) [E24J19]
目录号: F8879
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (thymidine, 2 mM, 16 h)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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120 kDa
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| 阳性对照 | HT-29 cells (Thymidine, 2 mM, 16 h; Nocodazole, 10 nM, 24 h); 293T cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-GEF-H1 (Ser886) Antibody (Rabbit mAb) [E24J19] 仅识别 Ser886 处磷酸化的内源性 GEF-H1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，细胞突起，细胞质，细胞骨架，高尔基体，细胞紧密连接 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q92974 |
| 克隆号 |
|---|
| E24J19 |
| 别名 |
|---|
| Rho guanine nucleotide exchange factor 2, Guanine nucleotide exchange factor H1 (GEF‑H1), Microtubule‑regulated Rho‑GEF, Proliferating cell nucleolar antigen p40, ARHGEF2, KIAA0651, LFP40 |
| 背景 |
|---|
| Ser886位点的磷酸化GEF-H1代表鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEF-H1/ARHGEF2）的活化构象。GEF-H1是一种DH-PH结构域的RhoA特异性GEF，它在微管相关抑制和胞质激活之间循环，从而驱动肌动蛋白动力学和收缩性。GEF-H1具有N端微管结合C1结构域、催化RhoA上GDP/GTP交换的中央DH-PH GEF模块以及C端卷曲螺旋和14-3-3结合基序，其中包括含有Ser886的RSLS基序。Par1b/MARK2激酶对Ser886的磷酸化破坏了GEF-H1与微管的结合，使其释放到胞质中，并与RhoA结合，促进应力纤维形成、黏着斑成熟和肌动球蛋白收缩。相反，PP2A介导的去磷酸化作用可恢复微管的结合，从而实现微管的隔离。在胞质分裂过程中，有丝分裂激酶如Aurora B磷酸化Ser886，使GEF-H1定位于分裂沟，激活皮质RhoA，从而促进赤道收缩和膜内陷，这一过程独立于中心纺锤体蛋白-Ect2。紧密连接蛋白cingulin结合并抑制GEF-H1 RhoGEF活性，以维持上皮屏障的完整性；而肥大细胞中的FcεRI信号通路则激活GEF-H1，促进颗粒胞吐。Par1b靶向C1结构域附近的三个保守丝氨酸残基（包括Ser886），将动态的微管周转转化为突起中的微管稳定，从而实现细胞极化。磷酸化的Ser886 GEF-H1协调微管解聚与RhoA介导的细胞骨架重塑，参与细胞迁移、分裂和屏障功能。失调会促进癌细胞侵袭，并破坏神经系统疾病中的极性。 |
| 参考文献 |
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