Phospho-GSK-3α/β (Ser21/9) Antibody [N3H2]

目录号: F0496

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: COS-7 (λ phosphatase treated), Lane 2: COS-7 (PDGF, 100ng/mL, 5 min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
51 kDa, 46 kDa

阳性对照	COS-7 cell (PDGF-treated); C6 cell; 293 cell (Insulin, 100nM, 20 min); NIH/3T3 cell (PDGF, 100ng/mL, 5 min); HeLa cell
阴性对照	COS-7 cell; C6 cell (PDGF, 100ng/mL, 5 min); 293 cell; NIH/3T3 cell

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-GSK-3α/β (Ser21/9) Antibody [N3H2] 仅识别 Ser21 处磷酸化的内源性 GSK-3α 和 Ser9 处磷酸化的内源性 GSK-3β 蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内膜系统，细胞核

Uniprot ID
P49840, P49841

克隆号
N3H2

别名
Glycogen synthase kinase-3 alpha; GSK-3 alpha; Serine/threonine-protein kinase GSK3A; GSK3A; Glycogen synthase kinase-3 beta; GSK-3 beta; Serine/threonine-protein kinase GSK3B; GSK3B

背景
磷酸化GSK-3α/β (Ser21/9) 代表糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 的失活形式。GSK-3 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包含两种亚型：GSK-3α 和 GSK-3β，广泛表达于各种组织中，最初因其在糖原代谢调控中的作用而被发现。GSK-3 的 N 端区域包含关键的调控丝氨酸残基 Ser21（GSK-3α）和 Ser9（GSK-3β）。当这两个残基被磷酸化后，它们会作为假底物，竞争性地抑制底物进入催化结构域中预先结合的底物口袋；此外，激活还依赖于激活环中 Tyr279（GSK-3α）或 Tyr216（GSK-3β）的磷酸化。 GSK-3 在未受刺激的细胞中保持组成型活性，但主要通过激酶（如 Akt，其在生长因子、胰岛素或应激刺激下通过 PI3K 通路激活）对 Ser21/9 位点的磷酸化而失活。这种磷酸化会阻断底物结合，并抑制超过 100 个靶点的磷酸化，这些靶点需要位于该位点 C 端四个氨基酸残基处的启动磷酸残基。这种失活通过阻止 GSK-3 介导的 β-catenin 降解来促进糖原合成、细胞存活、增殖以及 Wnt 信号通路等过程，同时抑制细胞凋亡、tau 蛋白过度磷酸化（与阿尔茨海默病相关）和细胞周期蛋白 D1 的周转。磷酸酶（如 PP1、PP2A 或 PP2B）对 Ser21/9 位点的去磷酸化可重新激活 GSK-3，当这种去磷酸化失调时，会导致神经退行性疾病、癌症和代谢紊乱。

背景

磷酸化GSK-3α/β (Ser21/9) 代表糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 的失活形式。GSK-3 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包含两种亚型：GSK-3α 和 GSK-3β，广泛表达于各种组织中，最初因其在糖原代谢调控中的作用而被发现。GSK-3 的 N 端区域包含关键的调控丝氨酸残基 Ser21（GSK-3α）和 Ser9（GSK-3β）。当这两个残基被磷酸化后，它们会作为假底物，竞争性地抑制底物进入催化结构域中预先结合的底物口袋；此外，激活还依赖于激活环中 Tyr279（GSK-3α）或 Tyr216（GSK-3β）的磷酸化。 GSK-3 在未受刺激的细胞中保持组成型活性，但主要通过激酶（如 Akt，其在生长因子、胰岛素或应激刺激下通过 PI3K 通路激活）对 Ser21/9 位点的磷酸化而失活。这种磷酸化会阻断底物结合，并抑制超过 100 个靶点的磷酸化，这些靶点需要位于该位点 C 端四个氨基酸残基处的启动磷酸残基。这种失活通过阻止 GSK-3 介导的 β-catenin 降解来促进糖原合成、细胞存活、增殖以及 Wnt 信号通路等过程，同时抑制细胞凋亡、tau 蛋白过度磷酸化（与阿尔茨海默病相关）和细胞周期蛋白 D1 的周转。磷酸酶（如 PP1、PP2A 或 PP2B）对 Ser21/9 位点的去磷酸化可重新激活 GSK-3，当这种去磷酸化失调时，会导致神经退行性疾病、癌症和代谢紊乱。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11035810/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25435019/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%