Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1139) Antibody (Rabbit mAb) [L15E14]
目录号: F2902
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SKBR3, Lane 2: SKBR3 (EGF treated)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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137 kDa
185 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | A431 cells (Epidermal Growth Factor treated); SKBR3 cells (EGF treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | SKBR3 cells; A431 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-HER2/ErbB2 (Tyr1139) Antibody (Rabbit mAb) [L15E14] 仅识别 Tyr1139 处磷酸化的内源性 HER2/ErbB2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，细胞质，内体，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P04626 |
| 克隆号 |
|---|
| L15E14 |
| 别名 |
|---|
| CD340, HER2, MLN19, NEU, NGL, ERBB2, Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, Metastatic lymph node gene 19 protein, Proto-oncogene Neu, Proto-oncogene c-ErbB-2, Tyrosine kinase-type cell surface receptor HER2, p185erbB2, MLN 19 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化HER2/ErbB2 (Tyr1139) 指的是活化的受体酪氨酸激酶ERBB2在其特定的C端酪氨酸残基上发生磷酸化，该酪氨酸残基可作为SH2结构域衔接蛋白的结合位点，并调控下游信号通路。HER2是EGFR/ErbB家族的成员，过表达时可形成配体非依赖性同源二聚体，也可与配体结合的伴侣（如EGFR和HER3）形成异源二聚体。其胞内激酶结构域的转录激活后，会在多个胞质酪氨酸残基上发生自磷酸化。Tyr1139位于胞内尾部，与多个自磷酸化位点聚集在一起。磷酸化后，Tyr1139可直接结合SH2结构域衔接蛋白GRB7，形成一个不同于ERBIN结合位点Tyr1248或CBL结合位点Tyr1112的特异性募集平台。 GRB7 与磷酸化 Tyr1139 的结合将活化的 HER2 与黏着斑成分和小 GTP 酶信号通路连接起来，并与 HER2 过表达模型中的细胞迁移、黏附重塑和极性破坏有关，在这些模型中，Tyr1139 和 Tyr1196 均被强烈磷酸化。在乳腺癌和其他癌中，HER2 过表达会导致多个尾部酪氨酸（包括 Tyr1139）的组成型磷酸化，并且与单独表达 HER2 相比，高水平的磷酸化 HER2 与淋巴结转移增加、增殖指数升高以及无病生存期和疾病特异性生存期缩短相关。 |
| 参考文献 |
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