Phospho-HSF1 (Ser326) Antibody [G8N16]

目录号: F1157

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (43℃, 30 min), Lane 3: HeLa (43℃, 30 min; alkaline phosphatase treated)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:5000 - 1:10000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
57 kDa 82 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HeLa cells (heat at 43℃ for 30 minutes); HeLa cells (heat 42 ℃)
阴性对照	HeLa cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-HSF1 (Ser326) Antibody [G8N16] 仅识别 Ser326 处磷酸化的内源性 HSF1 蛋白水平。

蛋白定位
着丝粒，染色体，细胞质，细胞骨架，动粒，细胞核

Uniprot ID
Q00613

克隆号
G8N16

别名
HSTF1; HSF1; Heat shock factor protein 1; HSF 1; Heat shock transcription factor 1; HSTF 1

背景
磷酸化HSF1（Ser326）是热休克因子1的激活形式，HSF1是一种重要的应激反应转录因子，能够快速诱导热休克蛋白（HSP）如HSP70和HSP90的表达，从而在热、氧化损伤或蛋白质聚集等蛋白毒性应激期间维持蛋白质稳态。HSF1包含一个N端DNA结合域，该域具有翼状螺旋基序，可识别热休克元件（HSE；nGAAn五聚体）；相邻的HR-A/B卷曲螺旋区域可促进三聚化；一个富含丝氨酸-脯氨酸的调控域，其中Ser326的磷酸化（由p38/MAPKAPK2介导）可增强三聚体的稳定性和核内滞留；以及一个C端激活域，该域可募集CDK9/P-TEFb以进行转录延伸。在应激条件下，Ser326位点的磷酸化使HSF1从潜在的、与HSP90结合的单体转变为高磷酸化的三聚体，从而增强其DNA结合亲和力和转录活性。磷酸化的Ser326与其他磷酸化位点（如Ser230（CAMKII）和Thr142）协同作用，增强HSP基因转录，通过HSP27/70介导的底物折叠抑制细胞凋亡，通过PLK1串扰调节有丝分裂纺锤体动力学，并通过EP300的共募集促进HIV-1 LTR的再激活。磷酸化HSF1（Ser326）水平升高通过支持化疗耐药性、癌症干细胞存活和转移促进癌症进展，尤其是在卵巢癌中；而信号传导失调则通过持续的蛋白毒性应激反应导致神经退行性变和慢性炎症。

背景

磷酸化HSF1（Ser326）是热休克因子1的激活形式，HSF1是一种重要的应激反应转录因子，能够快速诱导热休克蛋白（HSP）如HSP70和HSP90的表达，从而在热、氧化损伤或蛋白质聚集等蛋白毒性应激期间维持蛋白质稳态。HSF1包含一个N端DNA结合域，该域具有翼状螺旋基序，可识别热休克元件（HSE；nGAAn五聚体）；相邻的HR-A/B卷曲螺旋区域可促进三聚化；一个富含丝氨酸-脯氨酸的调控域，其中Ser326的磷酸化（由p38/MAPKAPK2介导）可增强三聚体的稳定性和核内滞留；以及一个C端激活域，该域可募集CDK9/P-TEFb以进行转录延伸。在应激条件下，Ser326位点的磷酸化使HSF1从潜在的、与HSP90结合的单体转变为高磷酸化的三聚体，从而增强其DNA结合亲和力和转录活性。磷酸化的Ser326与其他磷酸化位点（如Ser230（CAMKII）和Thr142）协同作用，增强HSP基因转录，通过HSP27/70介导的底物折叠抑制细胞凋亡，通过PLK1串扰调节有丝分裂纺锤体动力学，并通过EP300的共募集促进HIV-1 LTR的再激活。磷酸化HSF1（Ser326）水平升高通过支持化疗耐药性、癌症干细胞存活和转移促进癌症进展，尤其是在卵巢癌中；而信号传导失调则通过持续的蛋白毒性应激反应导致神经退行性变和慢性炎症。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28415561/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40520012/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%