Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) Antibody [G2K20]

目录号: F0854

抗体应用：反应性：Human

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
55 kDa

阳性对照	KARPAS-299 cells (hIL-1β, 50 ng/ml, 15 min)
阴性对照	KARPAS-299 cells (serum-starved)

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) Antibody [G2K20] 仅识别 Thr345/Ser346 处磷酸化的内源性 IRAK4 蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
Q9NWZ3

克隆号
G2K20

别名
Interleukin-1 receptor-associated kinase 4; IRAK-4; Renal carcinoma antigen NY-REN-64; IRAK4

背景
磷酸化IRAK4 (Thr345/Ser346) 是丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK4的活化形式，IRAK4是先天免疫信号传导的关键介质，其信号传导通过IL-1R和Toll样受体(TLR)发挥作用。IRAK4包含一个N端死亡结构域，用于与MyD88结合，以及一个C端激酶结构域，该结构域包含必需的激活环残基（Thr342、Thr345、Ser346和Thr352）。受体刺激后，MyD88募集IRAK4，触发其二聚化和分子间自磷酸化，主要发生在Thr345/Ser346位点，这是激酶完全激活所必需的。Thr342、Thr345或Ser346中任意两个残基的磷酸化均足以激活IRAK4。这种磷酸化发生在IL-1或TLR激动剂刺激后15-30分钟，并可被IRAK4抑制剂阻断。磷酸化使IRAK4能够磷酸化下游靶点，如Pellino1和IRAK1，进而导致Myddosome的形成以及TAK1、IKK（NF-κB通路）和MAPK（JNK、p38、ERK）的激活，最终导致细胞因子（例如IL-6、TNF-α）的产生。磷酸化IRAK4的功能影响具有细胞类型特异性：在原代人单核细胞中，激酶抑制会降低细胞因子的产生；而在真皮成纤维细胞中，IRAK4的支架功能足以进行信号传导，尽管在IRAK4缺陷细胞中这两种功能均丧失。IRAK4活性失调与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关，激酶失活突变体在关节炎等模型中具有保护作用。虽然 IRAK4 具有一定的基础活性，但在免疫激活后会高度磷酸化。

背景

磷酸化IRAK4 (Thr345/Ser346) 是丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK4的活化形式，IRAK4是先天免疫信号传导的关键介质，其信号传导通过IL-1R和Toll样受体(TLR)发挥作用。IRAK4包含一个N端死亡结构域，用于与MyD88结合，以及一个C端激酶结构域，该结构域包含必需的激活环残基（Thr342、Thr345、Ser346和Thr352）。受体刺激后，MyD88募集IRAK4，触发其二聚化和分子间自磷酸化，主要发生在Thr345/Ser346位点，这是激酶完全激活所必需的。Thr342、Thr345或Ser346中任意两个残基的磷酸化均足以激活IRAK4。这种磷酸化发生在IL-1或TLR激动剂刺激后15-30分钟，并可被IRAK4抑制剂阻断。磷酸化使IRAK4能够磷酸化下游靶点，如Pellino1和IRAK1，进而导致Myddosome的形成以及TAK1、IKK（NF-κB通路）和MAPK（JNK、p38、ERK）的激活，最终导致细胞因子（例如IL-6、TNF-α）的产生。磷酸化IRAK4的功能影响具有细胞类型特异性：在原代人单核细胞中，激酶抑制会降低细胞因子的产生；而在真皮成纤维细胞中，IRAK4的支架功能足以进行信号传导，尽管在IRAK4缺陷细胞中这两种功能均丧失。IRAK4活性失调与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关，激酶失活突变体在关节炎等模型中具有保护作用。虽然 IRAK4 具有一定的基础活性，但在免疫激活后会高度磷酸化。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28512203/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24567333/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技术支持

在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。

* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%