Phospho-JAK1 (Tyr1034/1035)/JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody (Mouse mAb) [L3G19]
目录号: F2644
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: U266, Lane 2: U266 (IFNα, 50ng/ml, 15 min)
客户使用该产品的实验数据
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议曝光 90s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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131 kDa
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| 阳性对照 | BaF3 cell (Mouse IL-3, 10ng/ml, 5 min); U266 cell (IFNα, 50ng/ml, 15 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | U266 cell |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。
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| IP |
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实验步骤：
实验试剂与准备
1.基础缓冲液：1X PBS或1X TBS（冰浴预冷）；1X 细胞裂解液（临用前添加 1 mM PMSF 蛋白酶抑制剂；磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂）。
2.捕获介质：Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（Sepharose beads）。
3.对照组：使用与一抗来源种属及 IgG 亚型相同、浓度相同的同型对照 IgG（isotype control）。建议同时保留一部分未经免疫沉淀的细胞裂解液作为 Input 对照；必要时可设置仅加入珠子、不加入抗体的 beads-only 对照。
4.上样与洗脱试剂：3X 或 4X SDS 上样缓冲液（含 DTT/还原剂）；如需进行非变性洗脱，可另行准备相应洗脱缓冲液及中和缓冲液；若采用变性洗脱，通常使用 1× PBS 将 3× 或 4× SDS 上样缓冲液稀释至 1×。
细胞裂解与样品制备（提取天然蛋白）
1.收集细胞：弃去培养基，用冰冷 1X PBS 洗涤细胞一次。
2.裂解细胞：向 10 cm 培养皿中加入 0.5-1 mL 冰浴 1X 细胞裂解液，冰上孵育 5–10 分钟。
3.收集裂解液并离心澄清：刮取细胞，将细胞裂解物转移至微量离心管中。一些贴壁细胞可能需要使用消化酶或机械方法进行分离。随后在 4°C、14,000 rpm 条件下离心 5-15 min，收集上清液，即为澄清后的细胞裂解液。建议测定蛋白浓度。
预清除与免疫沉淀反应
1.裂解液预清除（推荐）：取适量珠子（磁珠或琼脂糖珠），用细胞裂解液或1X TBS/PBS预洗 2–3 次。珠子预洗后，建议尽量去除洗液，再加入后续试剂，以避免额外稀释样品。对于含去污剂或特定盐浓度的裂解体系，优先使用与裂解液相同或相容的缓冲液预洗，以减少缓冲体系突变。
2.预清除处理：将细胞裂解液与预洗后的珠子混合，室温旋转孵育30-60 min，或4°C旋转孵育1-2 h。
若使用琼脂糖珠，孵育结束后通过离心沉降珠子，并收集上清液。
若使用磁珠，孵育结束后通过磁力架分离珠子，并收集上清液。
该步骤用于去除可与珠子发生非特异性结合的蛋白。对于不稳定蛋白、磷酸化蛋白或蛋白复合物，建议优先采用 4°C 孵育，以减少蛋白降解、去磷酸化或复合物解离。预清除使用的珠子通常不应预先偶联特异性抗体，以免损失目标抗原。
3.形成“珠子–抗体–抗原”免疫复合物
可采用以下两种方式之一：
3.1 先形成抗体-抗原复合物，再加入珠子：向步骤 2 获得的预清除上清液中加入适量一抗，同时设置同型对照 IgG 组。在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h，以形成抗体–抗原复合物。
另取适量珠子，并按照本节步骤 1 的方法预洗。将抗体–抗原复合物加入预洗后的磁珠或琼脂糖珠中，在室温下旋转孵育 30 min–1 h，或在 4°C 下旋转孵育 1–2 h，使抗体–抗原复合物充分结合至珠子。
3.2 先形成珠子-抗体复合物，再加入细胞裂解液：按照抗体说明书推荐的稀释比例，使用细胞裂解液稀释一抗，配制抗体工作液。向抗体工作液中加入适量预洗后的磁珠，在室温下旋转孵育 15 min，或在 4°C 下旋转孵育 1 h，以形成珠子–抗体复合物。
通过磁性分离或离心沉降珠子，弃去上清液，并使用 1× TBS 预洗珠子 2–3 次。随后加入细胞裂解液，在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h。
沉淀物洗涤与样品洗脱
1.免疫沉淀完成后，根据珠子类型进行分离，并弃去上清液。
磁珠使用磁力架进行磁性分离
琼脂糖珠应采用与所用珠子规格相匹配的低速离心条件（500–1000 rpm），避免高速离心造成珠子压实或损伤。
2.洗涤珠子：使用冰浴预冷的 1× 细胞裂解液或 1× TBS/TBST 轻柔洗涤珠子 3–5 次。洗涤过程中保持低温。每次加入洗涤液后，轻柔混匀，使珠子充分重悬；随后根据珠子类型使用磁力架或适当的离心条件分离珠子，并彻底去除洗涤液，以尽可能降低未结合及非特异性结合成分。每次洗涤时应尽量去除上清，但需避免吸走珠子。最后一次洗涤后应尽可能去除残余洗涤液，以免稀释洗脱液或影响后续分析。每次洗涤后将样品置于冰上。
3.样品洗脱（二选一）：
3.1变性直接洗脱法（最常用）：向珠子沉淀中加入 SDS 上样缓冲液，确保终浓度为 1×。若使用 3× 或 4× SDS 上样缓冲液，应先稀释至1×。混匀后加热至 95–100°C 保持 5 分钟。分离珠子，收集上清用于后续电泳。
3.2化学/非变性洗脱法（保留蛋白活性）：最后一次洗涤完成后，根据珠子类型使用磁力架或低速离心分离珠子，并尽可能去除残余洗涤液，避免稀释洗脱液。向珠子中加入适量酸性洗脱液/高盐洗脱液，使珠子充分重悬。在室温下轻柔混匀并短时间孵育，使免疫复合物从珠子上解离。使用磁力架或低速离心分离珠子，将洗脱上清液转移至预先加入适量中和缓冲液的收集管中，如有需要，进行必要的 pH 调节。如需提高回收率，可重复洗脱，并合并各次洗脱液。洗脱液、中和缓冲液的组成及用量应根据所用珠子和试剂盒的说明书确定。
3.3 洗脱后的样品处理
用于蛋白活性、天然蛋白复合物或其他非变性分析时：不加入 SDS 上样缓冲液；将样品置于冰上，并尽快用于后续实验。
用于 SDS-PAGE 或 Western blot 时：向中和或脱盐后的洗脱液中加入 SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，再按照后续电泳要求处理样品。
根据目标蛋白的稳定性及下游实验要求选择适宜的保存条件，并尽量避免反复冻融。
下游分析
Western Blot 分析：取上清进行 SDS-PAGE 电泳及转膜。建议使用轻重链特异性或构象特异性（Conformation Specific）二抗，以避免免疫球蛋白重/轻链（50 kDa / 25 kDa）条带对目的蛋白检测的干扰。建议在同一 Western blot 中设置 Input、同型对照 IgG-IP 和目标抗体-IP 样品；必要时还可加入 beads-only 对照，以评估免疫沉淀效率和非特异性结合。 激酶活性检测（如适用）：跳过变性步骤，用激酶缓冲液洗涤珠子后，直接加入底物与 ATP 进行激酶反应。
注意：整个裂解与免疫沉淀操作流程均应在 4°C 或冰浴条件下进行，以最大程度保持蛋白质的天然构象并防止其降解。 |
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-JAK1 (Tyr1034/1035)/JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody (Mouse mAb) [L3G19] 仅识别 Tyr1007 和 Tyr1008 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平，Tyr1034 和 Tyr1035 处磷酸化的内源性 JAK1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O60674, P23458 |
| 克隆号 |
|---|
| L3G19 |
| 别名 |
|---|
| JAK-2 | JAK2 | Janus kinase 2 | Janus kinase 2 (a protein tyrosine kinase) | JTK10 | Tyrosine-protein kinase JAK2 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化JAK2 (Tyr1007/1008) 代表Janus激酶JAK1和JAK2的活化形式，它们属于JAK家族，属于非受体酪氨酸激酶，介导细胞因子和生长因子受体信号转导。从结构上讲，JAK包含七个保守的Janus同源结构域 (JH1-JH7)：一个用于受体结合的N端FERM结构域、一个SH2样结构域、一个调节性假激酶结构域 (JH2) 和一个C端酪氨酸激酶结构域 (JH1)。它们与多种细胞因子受体的胞质尾部组成性相关，并普遍表达，其中 JAK1 广泛参与干扰素和 γc 家族细胞因子信号转导，JAK2 对促红细胞生成素、血小板生成素、GM-CSF 和其他造血细胞因子通路至关重要。它们的功能是磷酸化受体链和 STAT 转录因子，从而启动控制免疫、造血和发育的基因表达程序。JAK1 在 Tyr1034/1035 处的磷酸化和 JAK2 在 Tyr1007/1008 处的磷酸化发生在 JH1 激酶结构域的激活环内，是稳定激酶活性构象的关键事件。这些残基通过细胞因子诱导的受体二聚化和 JAK 分子间的转磷酸化进行磷酸化，从而减轻假激酶结构域的自身抑制。这种磷酸化是完全激活催化活性所必需的，从而能够有效磷酸化下游底物（受体、STAT 和 JAK 本身）。因此，磷酸化 JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化 JAK2 (Tyr1007/1008) 是开启 JAK-STAT 信号传导的关键分子开关，并被广泛用作通路激活的生物标志物。 |
| 参考文献 |
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