Phospho-JAK2 (Tyr1007+1008) Antibody (Rabbit mAb) [A2P24]
目录号: F0522
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: C6, Lane 2: C6 (pervanadate, 50mM, 5 min)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Human, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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131 kDa
120 kDa, 60 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human differentiated squamous cell carcinoma of the cervix tissue; Jurkat cells (Pervanadate, 50mM, 5 min); Rat uterine cell line (Prolactin, 1µg/mL, 1 h); C6 cells (Pervanadate, 50mM, 5 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Mouse hippocampus; Mouse P240 hippocampus; Mouse P7 hippocampus; Rat hippocampus; Rat P7 hippocampus; Rat brain cortex; Human brain; Mouse brain; Jurkat cells; C6 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-JAK2 (Tyr1007+1008) Antibody (Rabbit mAb) [A2P24] 仅识别 Tyr1007+1008 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O60674 |
| 克隆号 |
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| A2P24 |
| 别名 |
|---|
| Tyrosine-protein kinase JAK2, Janus kinase 2, JAK-2, JAK2, JAK1A, JAK1B, JAK1, Tyrosine-protein kinase JAK1, Janus kinase 1, JAK-1 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化JAK2 (Tyr1007+Tyr1008) 指的是非受体酪氨酸激酶JAK2的活化形式。JAK2是Janus激酶家族的成员，它将许多I类和II类细胞因子受体与STAT依赖性转录以及其他信号级联反应偶联。JAK2的C端激酶(JH1)结构域包含一个激活环，该激活环由串联的酪氨酸残基Tyr1007和Tyr1008组成；配体诱导的受体二聚化使两个JAK2分子彼此靠近，从而允许这些残基发生跨膜自磷酸化，并导致激活环的构象重排，使JAK2从低活性基础状态转化为高活性催化状态，从而实现高效的ATP利用以及强大的自磷酸化和底物磷酸化。将Tyr1007/Tyr1008突变为不可磷酸化残基可显著降低激酶活性，但不会完全消除。生化分析表明，激活环的磷酸化是维持高活性状态（支持细胞因子信号的充分传递）所必需的，而未磷酸化的激活环仅支持微弱的基础活性。这表明Tyr1007的磷酸化是催化活性增强的关键决定因素，而Tyr1008则调节这种构象。诱导Tyr1007磷酸化的细胞因子刺激使JAK2能够磷酸化受体胞质尾部，并募集含有SH2结构域的效应分子，其中最主要的是STAT转录因子。这些效应分子随后在其关键酪氨酸残基上被磷酸化，并转位至细胞核，驱动控制增殖、存活、分化和炎症反应的基因程序。磷酸化的 Tyr1007 也参与负调控通路：具有磷酸化激活环的活化 JAK2 优先被细胞因子信号抑制蛋白 SOCS-1 识别，SOCS-1 靶向 JAK2 进行多聚泛素化和蛋白酶体降解，因此 Tyr1007 的磷酸化既创造了高活性状态，又标记了该激酶进行泛素依赖性周转，从而形成限制信号持续时间的反馈回路。 JAK2 在假激酶和激酶结构域中发生额外的磷酸化位点修饰，从而正向或负向调节其活性，但 Tyr1007/Tyr1008 仍然是多种受体系统（包括促红细胞生成素、促血小板生成素、生长激素和许多白细胞介素）催化激活的核心读数，这使得磷酸化 JAK2 (Tyr1007+Tyr1008) 成为造血和非造血组织中 JAK2-STAT 轴功能参与的广泛使用的标志物，并且是 JAK2 信号传导失调的疾病（如骨髓增生性肿瘤和细胞因子驱动的炎症状态）的关键节点。 |
| 参考文献 |
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