Phospho-LYN (Y397)/LCK (Y394)/HCK (Y411)/BLK (Y389) Antibody [G2C4]
目录号: F5584
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: K562, Lane 2: K562 (CIP treated)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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60 kDa
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| 阳性对照 | COLO 201 cells; GDM-1 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | COLO 201 cells (Dasatinib, 200 nM, 24 h); TT cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| Phospho-LYN (Y397)/LCK (Y394)/HCK (Y411)/BLK (Y389) Antibody [G2C4] 仅当 LYN、LCK、HCK 和 BLK 蛋白分别在 Y397、Y394、Y411 和 Y389 位点磷酸化时，才能检测内源性 LYN、LCK、HCK 和 BLK 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，高尔基体，细胞核，细胞连接，细胞突起，胞质囊泡，细胞骨架，溶酶体 |
| Uniprot ID |
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| P07948, P06239, P08631, P51451 |
| 克隆号 |
|---|
| G2C4 |
| 别名 |
|---|
| Tyrosine-protein kinase Lyn/Lck/Hck/Blk; LYN; LCK; HCK; BLK |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化LYN (Y397)/LCK (Y394)/HCK (Y411)/BLK (Y389) 代表Src家族激酶 (SFK) 的活化形式，它们通过激酶活化环的自身磷酸化传递来自免疫受体的信号。这些激酶具有保守的SH3-SH2激酶结构域架构，其中同源酪氨酸残基（对应于c-Src中的Y416）的磷酸化使活化环从催化裂隙中移位，从而允许ATP结合和底物进入，同时通过C端酪氨酸磷酸化解除自身抑制性的SH2结构域钳制。受体配体结合触发反式自磷酸化：TCR/CD3 聚集后 LCK Y394 激活，通过串联 ITAM 基序募集 ZAP-70，促进 PLCγ-IP3-Ca2+ 流和 NFAT 核转位，从而促进 T 细胞效应分化；LYN Y397 与 B 细胞中的 BCR/CD79a/b 结合，磷酸化 SYK 并激活 PI3K-AKT-mTOR 通路以维持细胞存活，同时通过募集 CD22/SHP-1 来平衡 ITIM 介导的抑制；HCK Y411 通过 SYK-Vav-Rac 级联反应驱动髓系吞噬细胞中的 FcγR 和整合素信号传导，该级联反应重组肌动蛋白以形成足突、组装 NADPH 氧化酶和释放细胞因子；BLK Y389 通过 BLNK-SYK 偶联支持前 BCR 检查点，从而在 B 淋巴细胞生成过程中强制执行轻链选择。双重磷酸化动力学，即激活环与C端尾部的磷酸化，整合了正向（CD28、CD40L）和负向（CD45、Csk）调控，从而校准免疫突触的成熟并预防自身免疫。这些磷酸化SFK蛋白控制胸腺选择、边缘区B细胞定位和巨噬细胞极化，其组织特异性表达模式反映了谱系定向。 |
| 参考文献 |
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