Phospho-MEK1 (Thr292) Antibody [F18G17]
目录号: F6346
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MDA-MB-231, Lane 2: C6, Lane 3: C6 (phosphatase treated), Lane 4: NIH/3T3
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
45 kDa
|
| 阳性对照 | MDA-MB-231 cells; NIH/3T3 cells; C6 cells; MEF cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-MEK1 (Thr292) Antibody [F18G17] 仅识别 Thr292 处磷酸化的内源性 MEK1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q02750 |
| 克隆号 |
|---|
| F18G17 |
| 别名 |
|---|
| Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1; MAP kinase kinase 1; MAPKK 1; MAP2K1; MEK1 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化MEK1（Thr292）是双特异性激酶MEK1上的关键负调控位点，MEK1位于Raf-MEK-ERK MAPK级联的核心，该级联控制细胞增殖、分化和黏附。MEK1包含一个富含脯氨酸的插入序列和一个激活环，该激活环的Ser217和Ser221位点可被Raf家族激酶磷酸化。此外，MEK1还包含一个包含Thr292的调控片段，该片段位于催化核心之外，但与MEK1-ERK2和MEK1-PAK1相互作用。在信号通路激活过程中，整合素和生长因子驱动的PAK1在Ser298位点磷酸化MEK1，促进MEK1-ERK2复合物的形成，并通过增强MEK1与上游Raf和下游ERK的相互作用，促进Raf-1介导的MEK1激活，从而增强ERK依赖性转录和细胞骨架重塑。 ERK依赖的MEK1在Thr292位点的磷酸化诱导了一个负反馈环路：ERK2介导的Thr292磷酸化降低了MEK1对ERK1/2的激酶活性，干扰了MEK1与ERK2的结合，并减弱了PAK1依赖的Ser298位点的磷酸化，从而抑制了后续Raf介导的激活环丝氨酸的磷酸化，并缩短了细胞黏附事件和有丝分裂原刺激后ERK信号的强度和持续时间。Thr292磷酸化起到时间刹车的作用，调节ERK的输出以响应机械信号和细胞外基质（ECM）的参与，而MEK1 Thr292磷酸化的失调与脑和肿瘤微环境中ERK反馈控制的紊乱有关。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
