Phospho-MST1/MST2 (T180 + T183) Antibody [B24N16]

目录号: F4812

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (Calyculin A treated)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:1000-1:2000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
56 kDa 59 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HeLa cells (Calyculin A treated)
阴性对照	HeLa cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-MST1/MST2 (T180 + T183) Antibody [B24N16] 仅识别分别在 T180 和 T183 处磷酸化的内源性 MST1/MST2 蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞骨架，细胞核

Uniprot ID
Q13188; Q13043

克隆号
B24N16

别名
KRS1; MST2; STK3; Serine/threonine‑protein kinase 3; Mammalian STE20‑like protein kinase 2; STE20‑like kinase MST2; Serine/threonine‑protein kinase Krs‑1; MST‑2

背景
磷酸化MST1/MST2 (T180/T183) 指的是无菌20样激酶MST1 (STK4) 和MST2 (STK3) 上的关键激活环磷酸化。MST1和MST2是Hippo信号通路的核心组分，通过协调调控细胞增殖和凋亡来控制器官大小。这些激酶具有保守的N端催化结构域（包含T环基序）和C端调控区段（包含核输出信号和SAV1结合位点）。激活途径有两种：一是细胞凋亡过程中caspase-3/7裂解后，T180/T183位点发生自身磷酸化，从而解除激酶结构域的自身抑制；二是经典Hippo信号通路，其中Tao激酶启动MST1/2寡聚化和反式磷酸化，使其与SAV1形成复合物，进而磷酸化并激活LATS1/2激酶。MST1/2-SAV1-LATS1/2复合物随后靶向YAP/TAZ共激活因子，使其Ser127位点发生抑制性磷酸化，促进其通过14-3-3蛋白结合和β-TRCP介导的降解而滞留在细胞质中，从而抑制TEAD依赖的生长促进基因（如CTGF和CYR61）的转录。该级联反应整合了多种输入信号，包括通过Merlin和黏附连接调控的细胞密度、通过AMPK串扰调控的能量状态以及机械信号，并将磷酸化T180/T183定位为Hippo信号通路通量的近端读数，从而抑制组织过度生长并启动受损细胞的凋亡。它调控上皮形态发生、肝脏再生和干细胞静止状态，使其成为研究人员在类器官中模拟组织稳态或通过磷酸化特异性生物传感器解析机械转导不可或缺的工具。低磷酸化导致的失调会释放YAP/TAZ的致癌活性，从而引发间皮瘤和肝细胞癌等癌症。

背景

磷酸化MST1/MST2 (T180/T183) 指的是无菌20样激酶MST1 (STK4) 和MST2 (STK3) 上的关键激活环磷酸化。MST1和MST2是Hippo信号通路的核心组分，通过协调调控细胞增殖和凋亡来控制器官大小。这些激酶具有保守的N端催化结构域（包含T环基序）和C端调控区段（包含核输出信号和SAV1结合位点）。激活途径有两种：一是细胞凋亡过程中caspase-3/7裂解后，T180/T183位点发生自身磷酸化，从而解除激酶结构域的自身抑制；二是经典Hippo信号通路，其中Tao激酶启动MST1/2寡聚化和反式磷酸化，使其与SAV1形成复合物，进而磷酸化并激活LATS1/2激酶。MST1/2-SAV1-LATS1/2复合物随后靶向YAP/TAZ共激活因子，使其Ser127位点发生抑制性磷酸化，促进其通过14-3-3蛋白结合和β-TRCP介导的降解而滞留在细胞质中，从而抑制TEAD依赖的生长促进基因（如CTGF和CYR61）的转录。该级联反应整合了多种输入信号，包括通过Merlin和黏附连接调控的细胞密度、通过AMPK串扰调控的能量状态以及机械信号，并将磷酸化T180/T183定位为Hippo信号通路通量的近端读数，从而抑制组织过度生长并启动受损细胞的凋亡。它调控上皮形态发生、肝脏再生和干细胞静止状态，使其成为研究人员在类器官中模拟组织稳态或通过磷酸化特异性生物传感器解析机械转导不可或缺的工具。低磷酸化导致的失调会释放YAP/TAZ的致癌活性，从而引发间皮瘤和肝细胞癌等癌症。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30038061/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19878874/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%