Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody [H20P20]

目录号: F1578

抗体应用：反应性：Human

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 - 1:10000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
289 kDa 289 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HeLa cells (serum-starved, overnight; PMA, 200 nM, 4 h); HEK-293 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody [H20P20] 仅识别 Ser2481 处磷酸化的内源性 mTOR 蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，胞质囊泡，内质网，高尔基体，溶酶体，微粒体，线粒体，细胞核

Uniprot ID
P42345

克隆号
H20P20

别名
mTOR; Serine/threonine-protein kinase mTOR; Mammalian target of rapamycin; Mechanistic target of rapamycin; Rapamycin and FKBP12 target 1; Rapamycin target protein 1; FRAP1; FRAP2; RAFT1; RAPT1

背景
磷酸化mTOR（Ser2481）是mTOR中心丝氨酸/苏氨酸激酶的自身磷酸化形式，是脊椎动物特有的雷帕霉素不敏感的mTORC2复合物组装和催化活性的生物标志物。Ser2481位于激酶结构域和FATC结构域之间的C端调控尾部，其磷酸化需要完整的mTORC2组分Rictor和mSin1，并可直接监测mTORC2的特异性活性。短期急性雷帕霉素治疗通常不影响磷酸化，但长期暴露于雷帕霉素会抑制复合物的组装，从而破坏磷酸化。 mTORC1主要通过PI3K/Akt依赖的Ser2448位点磷酸化进行标记，而mTORC2的Ser2481位点磷酸化对于AGC激酶的调控至关重要，它能够激活Akt的Ser473位点、PKCα（用于细胞骨架组织）以及SGK1（用于细胞存活）。因此，这种修饰能够独立于mTORC1的翻译调控，支持胰岛素/PI3K信号通路、代谢和合成代谢，从而促进细胞增殖和存活。在乳腺癌和肾癌中，磷酸化Ser2481的增加比Akt Ser473本身更能可靠地指示mTORC2的活性，能够直接预测对雷帕霉素类似物的敏感性以及使用mTORC1/2双重抑制剂进行有效治疗的必要性。

背景

磷酸化mTOR（Ser2481）是mTOR中心丝氨酸/苏氨酸激酶的自身磷酸化形式，是脊椎动物特有的雷帕霉素不敏感的mTORC2复合物组装和催化活性的生物标志物。Ser2481位于激酶结构域和FATC结构域之间的C端调控尾部，其磷酸化需要完整的mTORC2组分Rictor和mSin1，并可直接监测mTORC2的特异性活性。短期急性雷帕霉素治疗通常不影响磷酸化，但长期暴露于雷帕霉素会抑制复合物的组装，从而破坏磷酸化。 mTORC1主要通过PI3K/Akt依赖的Ser2448位点磷酸化进行标记，而mTORC2的Ser2481位点磷酸化对于AGC激酶的调控至关重要，它能够激活Akt的Ser473位点、PKCα（用于细胞骨架组织）以及SGK1（用于细胞存活）。因此，这种修饰能够独立于mTORC1的翻译调控，支持胰岛素/PI3K信号通路、代谢和合成代谢，从而促进细胞增殖和存活。在乳腺癌和肾癌中，磷酸化Ser2481的增加比Akt Ser473本身更能可靠地指示mTORC2的活性，能够直接预测对雷帕霉素类似物的敏感性以及使用mTORC1/2双重抑制剂进行有效治疗的必要性。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20022946/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19244117/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%