Phospho-PDGFR α/β (Tyr849/Tyr857) Antibody (Rabbit mAb) [B8C12]
目录号: F2630
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 3T3, Lane 2: 3T3 (hPDGF-BB, 50ng/ml, 10 min)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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123 kDa
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| 阳性对照 | NIH/3T3 cells (PDGFbb treated) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-PDGFR α/β (Tyr849/Tyr857) Antibody (Rabbit mAb) [B8C12] 仅识别 Tyr849 处磷酸化的内源性 PDGFR α 和 Tyr857 处磷酸化的内源性 PDGFR β 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，高尔基体，内膜系统，胞质囊泡，溶酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P16234, P09619 |
| 克隆号 |
|---|
| B8C12 |
| 别名 |
|---|
| Activated tyrosine kinase PDGFRB; CD140; CD140A; CD140a antigen; CD140B; IBGC4; IMF1; JTK12; KOGS; PDGF-R-alpha; PDGF-R-beta; PDGFR; PDGFR alpha; PDGFR beta; PDGFR-1; PDGFR-2; PDGFR-alpha; PDGFR-beta; PDGFR1; PDGFR2; PDGFRA; PDGFRalpha |
| 背景 |
|---|
| Tyr849 磷酸化的 PDGF 受体 α 和 Tyr857 磷酸化的 PDGF 受体 β 代表了密切相关的 III 类受体酪氨酸激酶的激活环磷酸酪氨酸状态，这些状态决定了它们的催化活性构象，并响应二硫键连接的 PDGF 二聚体（包括 PDGF-AA、AB、BB、CC 和 DD）的结合而启动下游信号级联网络，其中受体同源二聚体和 α/β 异源二聚体的结合模式具有亚型和二聚体特异性。这些受体具有共同的结构组织，包括一个具有五个免疫球蛋白样结构域的胞外配体结合区、一个跨膜区段和一个胞质部分，该胞质部分包含一个分裂的酪氨酸激酶结构域，该结构域具有激活环和激酶插入序列，两侧是近膜区和 C 端尾部的调控序列；配体结合驱动受体二聚化和反式自磷酸化，结构/功能分析确定 PDGFRα 中的 Tyr849 和 PDGFRβ 中的 Tyr857 位于激活环内，是关键的自磷酸化位点，其修饰可稳定活性激酶构象，并且对于有效磷酸化其他调节酪氨酸是 SH2 结构域信号效应分子的停靠位点所必需的。一旦 Tyr849/Tyr857 被磷酸化，PDGFRα/β 就会募集一系列含有 SH2 结构域的蛋白质，包括 GRB2-SOS 以激活 RAS-RAF-MEK-ERK，PI3K（通过 p85 与 PDGFRβ 中的 Tyr751 和邻近位点结合）以刺激 AKT 和 mTOR 信号传导，PLCγ 以驱动 DAG/IP₃ 介导的钙动员和 PKC 激活，SRC 家族激酶，SHP2 磷酸酶和 STAT 转录因子，共同控制有丝分裂、存活、肌动蛋白细胞骨架重塑、趋化性、血管生成以及间充质谱系（如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、周细胞和少突胶质细胞前体）的分化。 PDGFRα 同源二聚体优先结合 PDGF-AA、AB、BB 和 CC，PDGFRβ 同源二聚体结合 PDGF-BB 和 PDGF-DD 以及 PDGF-AB，而 α/β 异源二聚体对 PDGF-B、C 和 D 以及 PDGF-AB 有反应。这些不同的受体/配体组合，以及 PDGFRα 与 PDGFRβ 的细胞类型特异性表达，决定了增殖反应和趋化反应之间的平衡；PDGFRβ 同源二聚体和 α/β 异源二聚体是成纤维细胞和平滑肌细胞趋化性的强刺激因子，而 PDGFRα 同源二聚体可以抑制趋化性并将信号传导偏向增殖，其中 Tyr849/Tyr857 磷酸化是每个二聚体中非活性状态和信号传导活性状态之间的主要开关。 PDGF 信号传导和 PDGFRα/β 激活环磷酸化是器官发育的核心，包括肾小球毛细血管簇的形成、肺和肠道上皮的折叠以及神经嵴衍生的结缔组织模式形成。PDGF/PDGFR 通路的异常，如功能获得性受体突变或过度表达，会导致不受控制的间充质增殖和增强的血管生成，这是恶性肿瘤、血管增生性疾病和纤维化疾病的特征。识别 PDGFRα Tyr849 和 PDGFRβ Tyr857 的磷酸化特异性抗体被广泛用于量化生化分析和肿瘤样本中的受体激活状态和 PDGF 通路参与情况，Tyr849/Tyr857 磷酸化可作为 PDGFR 抑制剂和受体功能调节剂研究中的机制读数，这些抑制剂和调节剂靶向该激活环依赖性催化活性，以阻断 PDGF 驱动的生长、迁移和新生血管形成。 |
| 参考文献 |
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