Phospho-PDGFR α/β (Tyr849/Tyr857) Antibody (Rabbit mAb) [B8C12]
目录号: F2630
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 3T3, Lane 2: 3T3 (hPDGF-BB, 50ng/ml, 10 min)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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123 kDa
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| 阳性对照 | NIH/3T3 cells (PDGFbb treated) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IP |
|---|
实验步骤：
实验试剂与准备
1.基础缓冲液：1X PBS或1X TBS（冰浴预冷）；1X 细胞裂解液（临用前添加 1 mM PMSF 蛋白酶抑制剂；磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂）。
2.捕获介质：Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（Sepharose beads）。
3.对照组：使用与一抗来源种属及 IgG 亚型相同、浓度相同的同型对照 IgG（isotype control）。建议同时保留一部分未经免疫沉淀的细胞裂解液作为 Input 对照；必要时可设置仅加入珠子、不加入抗体的 beads-only 对照。
4.上样与洗脱试剂：3X 或 4X SDS 上样缓冲液（含 DTT/还原剂）；如需进行非变性洗脱，可另行准备相应洗脱缓冲液及中和缓冲液；若采用变性洗脱，通常使用 1× PBS 将 3× 或 4× SDS 上样缓冲液稀释至 1×。
细胞裂解与样品制备（提取天然蛋白）
1.收集细胞：弃去培养基，用冰冷 1X PBS 洗涤细胞一次。
2.裂解细胞：向 10 cm 培养皿中加入 0.5-1 mL 冰浴 1X 细胞裂解液，冰上孵育 5–10 分钟。
3.收集裂解液并离心澄清：刮取细胞，将细胞裂解物转移至微量离心管中。一些贴壁细胞可能需要使用消化酶或机械方法进行分离。随后在 4°C、14,000 rpm 条件下离心 5-15 min，收集上清液，即为澄清后的细胞裂解液。建议测定蛋白浓度。
预清除与免疫沉淀反应
1.裂解液预清除（推荐）：取适量珠子（磁珠或琼脂糖珠），用细胞裂解液或1X TBS/PBS预洗 2–3 次。珠子预洗后，建议尽量去除洗液，再加入后续试剂，以避免额外稀释样品。对于含去污剂或特定盐浓度的裂解体系，优先使用与裂解液相同或相容的缓冲液预洗，以减少缓冲体系突变。
2.预清除处理：将细胞裂解液与预洗后的珠子混合，室温旋转孵育30-60 min，或4°C旋转孵育1-2 h。
若使用琼脂糖珠，孵育结束后通过离心沉降珠子，并收集上清液。
若使用磁珠，孵育结束后通过磁力架分离珠子，并收集上清液。
该步骤用于去除可与珠子发生非特异性结合的蛋白。对于不稳定蛋白、磷酸化蛋白或蛋白复合物，建议优先采用 4°C 孵育，以减少蛋白降解、去磷酸化或复合物解离。预清除使用的珠子通常不应预先偶联特异性抗体，以免损失目标抗原。
3.形成“珠子–抗体–抗原”免疫复合物
可采用以下两种方式之一：
3.1 先形成抗体-抗原复合物，再加入珠子：向步骤 2 获得的预清除上清液中加入适量一抗，同时设置同型对照 IgG 组。在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h，以形成抗体–抗原复合物。
另取适量珠子，并按照本节步骤 1 的方法预洗。将抗体–抗原复合物加入预洗后的磁珠或琼脂糖珠中，在室温下旋转孵育 30 min–1 h，或在 4°C 下旋转孵育 1–2 h，使抗体–抗原复合物充分结合至珠子。
3.2 先形成珠子-抗体复合物，再加入细胞裂解液：按照抗体说明书推荐的稀释比例，使用细胞裂解液稀释一抗，配制抗体工作液。向抗体工作液中加入适量预洗后的磁珠，在室温下旋转孵育 15 min，或在 4°C 下旋转孵育 1 h，以形成珠子–抗体复合物。
通过磁性分离或离心沉降珠子，弃去上清液，并使用 1× TBS 预洗珠子 2–3 次。随后加入细胞裂解液，在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h。
沉淀物洗涤与样品洗脱
1.免疫沉淀完成后，根据珠子类型进行分离，并弃去上清液。
磁珠使用磁力架进行磁性分离
琼脂糖珠应采用与所用珠子规格相匹配的低速离心条件（500–1000 rpm），避免高速离心造成珠子压实或损伤。
2.洗涤珠子：使用冰浴预冷的 1× 细胞裂解液或 1× TBS/TBST 轻柔洗涤珠子 3–5 次。洗涤过程中保持低温。每次加入洗涤液后，轻柔混匀，使珠子充分重悬；随后根据珠子类型使用磁力架或适当的离心条件分离珠子，并彻底去除洗涤液，以尽可能降低未结合及非特异性结合成分。每次洗涤时应尽量去除上清，但需避免吸走珠子。最后一次洗涤后应尽可能去除残余洗涤液，以免稀释洗脱液或影响后续分析。每次洗涤后将样品置于冰上。
3.样品洗脱（二选一）：
3.1变性直接洗脱法（最常用）：向珠子沉淀中加入 SDS 上样缓冲液，确保终浓度为 1×。若使用 3× 或 4× SDS 上样缓冲液，应先稀释至1×。混匀后加热至 95–100°C 保持 5 分钟。分离珠子，收集上清用于后续电泳。
3.2化学/非变性洗脱法（保留蛋白活性）：最后一次洗涤完成后，根据珠子类型使用磁力架或低速离心分离珠子，并尽可能去除残余洗涤液，避免稀释洗脱液。向珠子中加入适量酸性洗脱液/高盐洗脱液，使珠子充分重悬。在室温下轻柔混匀并短时间孵育，使免疫复合物从珠子上解离。使用磁力架或低速离心分离珠子，将洗脱上清液转移至预先加入适量中和缓冲液的收集管中，如有需要，进行必要的 pH 调节。如需提高回收率，可重复洗脱，并合并各次洗脱液。洗脱液、中和缓冲液的组成及用量应根据所用珠子和试剂盒的说明书确定。
3.3 洗脱后的样品处理
用于蛋白活性、天然蛋白复合物或其他非变性分析时：不加入 SDS 上样缓冲液；将样品置于冰上，并尽快用于后续实验。
用于 SDS-PAGE 或 Western blot 时：向中和或脱盐后的洗脱液中加入 SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，再按照后续电泳要求处理样品。
根据目标蛋白的稳定性及下游实验要求选择适宜的保存条件，并尽量避免反复冻融。
下游分析
Western Blot 分析：取上清进行 SDS-PAGE 电泳及转膜。建议使用轻重链特异性或构象特异性（Conformation Specific）二抗，以避免免疫球蛋白重/轻链（50 kDa / 25 kDa）条带对目的蛋白检测的干扰。建议在同一 Western blot 中设置 Input、同型对照 IgG-IP 和目标抗体-IP 样品；必要时还可加入 beads-only 对照，以评估免疫沉淀效率和非特异性结合。 激酶活性检测（如适用）：跳过变性步骤，用激酶缓冲液洗涤珠子后，直接加入底物与 ATP 进行激酶反应。
注意：整个裂解与免疫沉淀操作流程均应在 4°C 或冰浴条件下进行，以最大程度保持蛋白质的天然构象并防止其降解。 |
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-PDGFR α/β (Tyr849/Tyr857) Antibody (Rabbit mAb) [B8C12] 仅识别 Tyr849 处磷酸化的内源性 PDGFR α 和 Tyr857 处磷酸化的内源性 PDGFR β 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，高尔基体，内膜系统，胞质囊泡，溶酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P16234, P09619 |
| 克隆号 |
|---|
| B8C12 |
| 别名 |
|---|
| Activated tyrosine kinase PDGFRB | Alpha platelet-derived growth factor receptor | Alpha-type platelet-derived growth factor receptor | Beta platelet-derived growth factor receptor | Beta-type platelet-derived growth factor receptor | CD140 | CD140 antigen-like family member A | CD140 antigen-like family member B | CD140A | CD140a antigen | CD140B | IBGC4 | IMF1 | JTK12 | KOGS | MGC74795 | NDEL1-PDGFRB | PDGF-R-alpha | PDGF-R-beta | PDGFR | PDGFR alpha | PDGFR beta | PDGFR-1 | PDGFR-2 | PDGFR-alpha | PDGFR-beta | PDGFR1 | PDGFR2 | PDGFRA | PDGFRalpha | PDGFRB | PENTT | PGFRA | PGFRB | platelet derived growth factor receptor alpha | platelet derived growth factor receptor beta | Platelet-derived growth factor alpha receptor | Platelet-derived growth factor receptor 1 | Platelet-derived growth factor receptor 2 | Platelet-derived growth factor receptor alpha | Platelet-derived growth factor receptor beta | platelet-derived growth factor receptor | alpha polypeptide | platelet-derived growth factor receptor | beta polypeptide | rearranged-in-hypereosinophilia-platelet derived growth factor receptor alpha fusion protein | RHEPDGFRA |
| 背景 |
|---|
| Tyr849 磷酸化的 PDGF 受体 α 和 Tyr857 磷酸化的 PDGF 受体 β 代表了密切相关的 III 类受体酪氨酸激酶的激活环磷酸酪氨酸状态，这些状态决定了它们的催化活性构象，并响应二硫键连接的 PDGF 二聚体（包括 PDGF-AA、AB、BB、CC 和 DD）的结合而启动下游信号级联网络，其中受体同源二聚体和 α/β 异源二聚体的结合模式具有亚型和二聚体特异性。这些受体具有共同的结构组织，包括一个具有五个免疫球蛋白样结构域的胞外配体结合区、一个跨膜区段和一个胞质部分，该胞质部分包含一个分裂的酪氨酸激酶结构域，该结构域具有激活环和激酶插入序列，两侧是近膜区和 C 端尾部的调控序列；配体结合驱动受体二聚化和反式自磷酸化，结构/功能分析确定 PDGFRα 中的 Tyr849 和 PDGFRβ 中的 Tyr857 位于激活环内，是关键的自磷酸化位点，其修饰可稳定活性激酶构象，并且对于有效磷酸化其他调节酪氨酸是 SH2 结构域信号效应分子的停靠位点所必需的。一旦 Tyr849/Tyr857 被磷酸化，PDGFRα/β 就会募集一系列含有 SH2 结构域的蛋白质，包括 GRB2-SOS 以激活 RAS-RAF-MEK-ERK，PI3K（通过 p85 与 PDGFRβ 中的 Tyr751 和邻近位点结合）以刺激 AKT 和 mTOR 信号传导，PLCγ 以驱动 DAG/IP₃ 介导的钙动员和 PKC 激活，SRC 家族激酶，SHP2 磷酸酶和 STAT 转录因子，共同控制有丝分裂、存活、肌动蛋白细胞骨架重塑、趋化性、血管生成以及间充质谱系（如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、周细胞和少突胶质细胞前体）的分化。 PDGFRα 同源二聚体优先结合 PDGF-AA、AB、BB 和 CC，PDGFRβ 同源二聚体结合 PDGF-BB 和 PDGF-DD 以及 PDGF-AB，而 α/β 异源二聚体对 PDGF-B、C 和 D 以及 PDGF-AB 有反应。这些不同的受体/配体组合，以及 PDGFRα 与 PDGFRβ 的细胞类型特异性表达，决定了增殖反应和趋化反应之间的平衡；PDGFRβ 同源二聚体和 α/β 异源二聚体是成纤维细胞和平滑肌细胞趋化性的强刺激因子，而 PDGFRα 同源二聚体可以抑制趋化性并将信号传导偏向增殖，其中 Tyr849/Tyr857 磷酸化是每个二聚体中非活性状态和信号传导活性状态之间的主要开关。 PDGF 信号传导和 PDGFRα/β 激活环磷酸化是器官发育的核心，包括肾小球毛细血管簇的形成、肺和肠道上皮的折叠以及神经嵴衍生的结缔组织模式形成。PDGF/PDGFR 通路的异常，如功能获得性受体突变或过度表达，会导致不受控制的间充质增殖和增强的血管生成，这是恶性肿瘤、血管增生性疾病和纤维化疾病的特征。识别 PDGFRα Tyr849 和 PDGFRβ Tyr857 的磷酸化特异性抗体被广泛用于量化生化分析和肿瘤样本中的受体激活状态和 PDGF 通路参与情况，Tyr849/Tyr857 磷酸化可作为 PDGFR 抑制剂和受体功能调节剂研究中的机制读数，这些抑制剂和调节剂靶向该激活环依赖性催化活性，以阻断 PDGF 驱动的生长、迁移和新生血管形成。 |
| 参考文献 |
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