Phospho-PERK (Thr980) Antibody (Rabbit mAb) [E9N5]
目录号: F2713
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: AR42J, Lane 2: AR42J (thapsigargin (Tg), 1 μM, 20 min)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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170 kDa
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| 阳性对照 | AR42J cells (Thapsigargin, 20 min); RSC96 cells (Thapsigargin, 300nM 2 h); RSC96 cells (Tunicamycin, 4 µg/mL, 2 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | RSC96 cells; AR42J cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Phospho-PERK (Thr980) Antibody (Rabbit mAb) [E9N5] 仅识别 Thr980 处磷酸化的内源性 PERK 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 内质网，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9NZJ5 |
| 克隆号 |
|---|
| E9N5 |
| 别名 |
|---|
| Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3; Pancreatic eIF2-alpha kinase; PRKR-like endoplasmic reticulum kinase; Protein tyrosine kinase EIF2AK3, Eif2ak3; PEK; Perk |
| 背景 |
|---|
磷酸化PERK（Thr980）是指蛋白激酶样内质网激酶（PERK/EIF2AK3）的活化形式。在该活化形式中，胞质激酶结构域活化环内的保守苏氨酸残基发生自身磷酸化，标志着未折叠蛋白反应的PERK通路被激活，并将内质网应激与翻译调控和下游信号传导相偶联。PERK是一种I型内质网跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，其腔内应激感知结构域在基础条件下与分子伴侣BiP结合；胞质激酶区域在BiP释放和错误折叠蛋白积累时发生二聚化和寡聚化，从而为活化环Thr980及其相关残基的磷酸化提供平台。 Thr980 的自磷酸化可稳定激酶结构域的活性构象，并使 eIF2α 在 Ser51 位点高效磷酸化，从而降低整体的帽依赖性翻译，同时允许选择性翻译应激反应 mRNA，包括 ATF4，进而降低内质网蛋白负荷，并启动氨基酸代谢、抗氧化防御和凋亡调节因子的转录程序。因此，Thr980 磷酸化被广泛用作 PERK 活性的生化替代指标。针对包含该残基的磷酸肽段制备的磷酸化特异性抗体，可在多种细胞类型中检测到经内质网应激剂（如衣霉素或毒胡萝卜素）处理后 P-Thr980 水平的升高。 PERK 信号传导通过细胞周期蛋白 D1 的丢失促进 G1 期生长停滞，并根据应激强度和持续时间促进适应或细胞死亡，PERK 缺陷（包括 EIF2AK3 的功能丧失突变）是沃尔科特-拉利森综合征的基础，强调了受调控的 PERK 激活在 β 细胞存活和系统稳态中的重要性。 |
| 参考文献 |
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