Phospho-PI 3 Kinase p85 β (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody (Rabbit mAb) [L18H21]

目录号: F0498

抗体应用：反应性：Mouse

Lane 1: NIH/3T3-Src, Lane 2: NIH/3T3-Src (Dasatinib, 200 nM, 24 h)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100 FCM1:50-1:200

抗体应用
WB, IP, FCM

反应性
Mouse

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
84, 54, 82 kDa 60 KDa, 85 KDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	NIH/3T3-Src cells
阴性对照	NIH/3T3-Src cells (Dasatinib, 200 nM, 24 h)

实验方法

IP
实验步骤：实验试剂与准备 1.基础缓冲液：1X PBS或1X TBS（冰浴预冷）；1X 细胞裂解液（临用前添加 1 mM PMSF 蛋白酶抑制剂；磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂）。 2.捕获介质：Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（Sepharose beads）。 3.对照组：使用与一抗来源种属及 IgG 亚型相同、浓度相同的同型对照 IgG（isotype control）。建议同时保留一部分未经免疫沉淀的细胞裂解液作为 Input 对照；必要时可设置仅加入珠子、不加入抗体的 beads-only 对照。 4.上样与洗脱试剂：3X 或 4X SDS 上样缓冲液（含 DTT/还原剂）；如需进行非变性洗脱，可另行准备相应洗脱缓冲液及中和缓冲液；若采用变性洗脱，通常使用 1× PBS 将 3× 或 4× SDS 上样缓冲液稀释至 1×。细胞裂解与样品制备（提取天然蛋白） 1.收集细胞：弃去培养基，用冰冷 1X PBS 洗涤细胞一次。 2.裂解细胞：向 10 cm 培养皿中加入 0.5-1 mL 冰浴 1X 细胞裂解液，冰上孵育 5–10 分钟。 3.收集裂解液并离心澄清：刮取细胞，将细胞裂解物转移至微量离心管中。一些贴壁细胞可能需要使用消化酶或机械方法进行分离。随后在 4°C、14,000 rpm 条件下离心 5-15 min，收集上清液，即为澄清后的细胞裂解液。建议测定蛋白浓度。预清除与免疫沉淀反应 1.裂解液预清除（推荐）：取适量珠子（磁珠或琼脂糖珠），用细胞裂解液或1X TBS/PBS预洗 2–3 次。珠子预洗后，建议尽量去除洗液，再加入后续试剂，以避免额外稀释样品。对于含去污剂或特定盐浓度的裂解体系，优先使用与裂解液相同或相容的缓冲液预洗，以减少缓冲体系突变。 2.预清除处理：将细胞裂解液与预洗后的珠子混合，室温旋转孵育30-60 min，或4°C旋转孵育1-2 h。若使用琼脂糖珠，孵育结束后通过离心沉降珠子，并收集上清液。若使用磁珠，孵育结束后通过磁力架分离珠子，并收集上清液。该步骤用于去除可与珠子发生非特异性结合的蛋白。对于不稳定蛋白、磷酸化蛋白或蛋白复合物，建议优先采用 4°C 孵育，以减少蛋白降解、去磷酸化或复合物解离。预清除使用的珠子通常不应预先偶联特异性抗体，以免损失目标抗原。 3.形成“珠子–抗体–抗原”免疫复合物可采用以下两种方式之一： 3.1 先形成抗体-抗原复合物，再加入珠子：向步骤 2 获得的预清除上清液中加入适量一抗，同时设置同型对照 IgG 组。在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h，以形成抗体–抗原复合物。另取适量珠子，并按照本节步骤 1 的方法预洗。将抗体–抗原复合物加入预洗后的磁珠或琼脂糖珠中，在室温下旋转孵育 30 min–1 h，或在 4°C 下旋转孵育 1–2 h，使抗体–抗原复合物充分结合至珠子。 3.2 先形成珠子-抗体复合物，再加入细胞裂解液：按照抗体说明书推荐的稀释比例，使用细胞裂解液稀释一抗，配制抗体工作液。向抗体工作液中加入适量预洗后的磁珠，在室温下旋转孵育 15 min，或在 4°C 下旋转孵育 1 h，以形成珠子–抗体复合物。通过磁性分离或离心沉降珠子，弃去上清液，并使用 1× TBS 预洗珠子 2–3 次。随后加入细胞裂解液，在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h。沉淀物洗涤与样品洗脱 1.免疫沉淀完成后，根据珠子类型进行分离，并弃去上清液。磁珠使用磁力架进行磁性分离琼脂糖珠应采用与所用珠子规格相匹配的低速离心条件（500–1000 rpm），避免高速离心造成珠子压实或损伤。 2.洗涤珠子：使用冰浴预冷的 1× 细胞裂解液或 1× TBS/TBST 轻柔洗涤珠子 3–5 次。洗涤过程中保持低温。每次加入洗涤液后，轻柔混匀，使珠子充分重悬；随后根据珠子类型使用磁力架或适当的离心条件分离珠子，并彻底去除洗涤液，以尽可能降低未结合及非特异性结合成分。每次洗涤时应尽量去除上清，但需避免吸走珠子。最后一次洗涤后应尽可能去除残余洗涤液，以免稀释洗脱液或影响后续分析。每次洗涤后将样品置于冰上。 3.样品洗脱（二选一）： 3.1变性直接洗脱法（最常用）：向珠子沉淀中加入 SDS 上样缓冲液，确保终浓度为 1×。若使用 3× 或 4× SDS 上样缓冲液，应先稀释至1×。混匀后加热至 95–100°C 保持 5 分钟。分离珠子，收集上清用于后续电泳。 3.2化学/非变性洗脱法（保留蛋白活性）：最后一次洗涤完成后，根据珠子类型使用磁力架或低速离心分离珠子，并尽可能去除残余洗涤液，避免稀释洗脱液。向珠子中加入适量酸性洗脱液/高盐洗脱液，使珠子充分重悬。在室温下轻柔混匀并短时间孵育，使免疫复合物从珠子上解离。使用磁力架或低速离心分离珠子，将洗脱上清液转移至预先加入适量中和缓冲液的收集管中，如有需要，进行必要的 pH 调节。如需提高回收率，可重复洗脱，并合并各次洗脱液。洗脱液、中和缓冲液的组成及用量应根据所用珠子和试剂盒的说明书确定。 3.3 洗脱后的样品处理用于蛋白活性、天然蛋白复合物或其他非变性分析时：不加入 SDS 上样缓冲液；将样品置于冰上，并尽快用于后续实验。用于 SDS-PAGE 或 Western blot 时：向中和或脱盐后的洗脱液中加入 SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，再按照后续电泳要求处理样品。根据目标蛋白的稳定性及下游实验要求选择适宜的保存条件，并尽量避免反复冻融。下游分析 Western Blot 分析：取上清进行 SDS-PAGE 电泳及转膜。建议使用轻重链特异性或构象特异性（Conformation Specific）二抗，以避免免疫球蛋白重/轻链（50 kDa / 25 kDa）条带对目的蛋白检测的干扰。建议在同一 Western blot 中设置 Input、同型对照 IgG-IP 和目标抗体-IP 样品；必要时还可加入 beads-only 对照，以评估免疫沉淀效率和非特异性结合。激酶活性检测（如适用）：跳过变性步骤，用激酶缓冲液洗涤珠子后，直接加入底物与 ATP 进行激酶反应。注意：整个裂解与免疫沉淀操作流程均应在 4°C 或冰浴条件下进行，以最大程度保持蛋白质的天然构象并防止其降解。

实验步骤：

实验试剂与准备

1.基础缓冲液：1X PBS或1X TBS（冰浴预冷）；1X 细胞裂解液（临用前添加 1 mM PMSF 蛋白酶抑制剂；磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂）。

2.捕获介质：Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（Sepharose beads）。

3.对照组：使用与一抗来源种属及 IgG 亚型相同、浓度相同的同型对照 IgG（isotype control）。建议同时保留一部分未经免疫沉淀的细胞裂解液作为 Input 对照；必要时可设置仅加入珠子、不加入抗体的 beads-only 对照。

4.上样与洗脱试剂：3X 或 4X SDS 上样缓冲液（含 DTT/还原剂）；如需进行非变性洗脱，可另行准备相应洗脱缓冲液及中和缓冲液；若采用变性洗脱，通常使用 1× PBS 将 3× 或 4× SDS 上样缓冲液稀释至 1×。

细胞裂解与样品制备（提取天然蛋白）

1.收集细胞：弃去培养基，用冰冷 1X PBS 洗涤细胞一次。

2.裂解细胞：向 10 cm 培养皿中加入 0.5-1 mL 冰浴 1X 细胞裂解液，冰上孵育 5–10 分钟。

3.收集裂解液并离心澄清：刮取细胞，将细胞裂解物转移至微量离心管中。一些贴壁细胞可能需要使用消化酶或机械方法进行分离。随后在 4°C、14,000 rpm 条件下离心 5-15 min，收集上清液，即为澄清后的细胞裂解液。建议测定蛋白浓度。

预清除与免疫沉淀反应

1.裂解液预清除（推荐）：取适量珠子（磁珠或琼脂糖珠），用细胞裂解液或1X TBS/PBS预洗 2–3 次。珠子预洗后，建议尽量去除洗液，再加入后续试剂，以避免额外稀释样品。对于含去污剂或特定盐浓度的裂解体系，优先使用与裂解液相同或相容的缓冲液预洗，以减少缓冲体系突变。

2.预清除处理：将细胞裂解液与预洗后的珠子混合，室温旋转孵育30-60 min，或4°C旋转孵育1-2 h。

若使用琼脂糖珠，孵育结束后通过离心沉降珠子，并收集上清液。

若使用磁珠，孵育结束后通过磁力架分离珠子，并收集上清液。

该步骤用于去除可与珠子发生非特异性结合的蛋白。对于不稳定蛋白、磷酸化蛋白或蛋白复合物，建议优先采用 4°C 孵育，以减少蛋白降解、去磷酸化或复合物解离。预清除使用的珠子通常不应预先偶联特异性抗体，以免损失目标抗原。

3.形成“珠子–抗体–抗原”免疫复合物

可采用以下两种方式之一：

3.1 先形成抗体-抗原复合物，再加入珠子：向步骤 2 获得的预清除上清液中加入适量一抗，同时设置同型对照 IgG 组。在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h，以形成抗体–抗原复合物。

另取适量珠子，并按照本节步骤 1 的方法预洗。将抗体–抗原复合物加入预洗后的磁珠或琼脂糖珠中，在室温下旋转孵育 30 min–1 h，或在 4°C 下旋转孵育 1–2 h，使抗体–抗原复合物充分结合至珠子。

3.2 先形成珠子-抗体复合物，再加入细胞裂解液：按照抗体说明书推荐的稀释比例，使用细胞裂解液稀释一抗，配制抗体工作液。向抗体工作液中加入适量预洗后的磁珠，在室温下旋转孵育 15 min，或在 4°C 下旋转孵育 1 h，以形成珠子–抗体复合物。

通过磁性分离或离心沉降珠子，弃去上清液，并使用 1× TBS 预洗珠子 2–3 次。随后加入细胞裂解液，在 4°C 下旋转孵育过夜（推荐），或在室温下旋转孵育 2 h。

沉淀物洗涤与样品洗脱

1.免疫沉淀完成后，根据珠子类型进行分离，并弃去上清液。

磁珠使用磁力架进行磁性分离

琼脂糖珠应采用与所用珠子规格相匹配的低速离心条件（500–1000 rpm），避免高速离心造成珠子压实或损伤。

2.洗涤珠子：使用冰浴预冷的 1× 细胞裂解液或 1× TBS/TBST 轻柔洗涤珠子 3–5 次。洗涤过程中保持低温。每次加入洗涤液后，轻柔混匀，使珠子充分重悬；随后根据珠子类型使用磁力架或适当的离心条件分离珠子，并彻底去除洗涤液，以尽可能降低未结合及非特异性结合成分。每次洗涤时应尽量去除上清，但需避免吸走珠子。最后一次洗涤后应尽可能去除残余洗涤液，以免稀释洗脱液或影响后续分析。每次洗涤后将样品置于冰上。

3.样品洗脱（二选一）：

3.1变性直接洗脱法（最常用）：向珠子沉淀中加入 SDS 上样缓冲液，确保终浓度为 1×。若使用 3× 或 4× SDS 上样缓冲液，应先稀释至1×。混匀后加热至 95–100°C 保持 5 分钟。分离珠子，收集上清用于后续电泳。

3.2化学/非变性洗脱法（保留蛋白活性）：最后一次洗涤完成后，根据珠子类型使用磁力架或低速离心分离珠子，并尽可能去除残余洗涤液，避免稀释洗脱液。向珠子中加入适量酸性洗脱液/高盐洗脱液，使珠子充分重悬。在室温下轻柔混匀并短时间孵育，使免疫复合物从珠子上解离。使用磁力架或低速离心分离珠子，将洗脱上清液转移至预先加入适量中和缓冲液的收集管中，如有需要，进行必要的 pH 调节。如需提高回收率，可重复洗脱，并合并各次洗脱液。洗脱液、中和缓冲液的组成及用量应根据所用珠子和试剂盒的说明书确定。

3.3 洗脱后的样品处理

用于蛋白活性、天然蛋白复合物或其他非变性分析时：不加入 SDS 上样缓冲液；将样品置于冰上，并尽快用于后续实验。

用于 SDS-PAGE 或 Western blot 时：向中和或脱盐后的洗脱液中加入 SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，再按照后续电泳要求处理样品。

根据目标蛋白的稳定性及下游实验要求选择适宜的保存条件，并尽量避免反复冻融。

下游分析

Western Blot 分析：取上清进行 SDS-PAGE 电泳及转膜。建议使用轻重链特异性或构象特异性（Conformation Specific）二抗，以避免免疫球蛋白重/轻链（50 kDa / 25 kDa）条带对目的蛋白检测的干扰。建议在同一 Western blot 中设置 Input、同型对照 IgG-IP 和目标抗体-IP 样品；必要时还可加入 beads-only 对照，以评估免疫沉淀效率和非特异性结合。激酶活性检测（如适用）：跳过变性步骤，用激酶缓冲液洗涤珠子后，直接加入底物与 ATP 进行激酶反应。

注意：整个裂解与免疫沉淀操作流程均应在 4°C 或冰浴条件下进行，以最大程度保持蛋白质的天然构象并防止其降解。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-PI 3 Kinase p85 β (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody (Rabbit mAb) [L18H21] 仅识别 Tyr458/Tyr199 处磷酸化的内源性 p85/p55 蛋白水平。

克隆号
L18H21

别名
100% homology to SWISS-PROT Q92569; AGM7; DKFZp686P05226; FLJ41892; GRB1; IMD36; MPPH; MPPH1; p55; p55-GAMMA; P55G; p55PIK; p85; p85-ALPHA; p85-BETA; P85A; P85B

背景
IA类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是由p110催化亚基和p85型调节亚基组成的异二聚体。p85调节亚基具有两种相反的功能：它既能稳定p110，又能抑制其基础催化活性。p85包含两个SH2结构域，其两侧是与p110紧密结合的SH2间螺旋卷曲区。在静息状态下，这种SH2-p110结构域使催化亚基处于抑制构象。酪氨酸磷酸化肽与p85的任一SH2结构域结合即可解除这种抑制，诱导p85/p110二聚体从抑制状态转变为去抑制状态，并使p110活性恢复到与未结合的单体p110相当的水平。这种激活性的磷酸酪氨酸结合在生理条件下发生：当生长因子或激素刺激受体酪氨酸激酶及其衔接蛋白发生酪氨酸磷酸化时，p85的SH2结构域被募集到质膜上的磷酸化受体复合物，从而将PI3K定位并激活于受体结合位点。对癌细胞系中酪氨酸磷酸化的大规模磷酸化蛋白质组学分析发现，p85的酪氨酸458和p55调节亚型的相应酪氨酸199是该激活过程中发生磷酸化的位点，这为PI3K通路激活提供了一个特异性的、可检测的标志物。由于 PTEN 通过使活化的 PI3K 的 PIP3 产物去磷酸化来拮抗该通路，并且由于 PTEN 功能的丧失在人类癌症中很常见，因此 p85/p55 在这些酪氨酸上的磷酸化状态可作为肿瘤细胞中组成型 PI3K 通路激活的指标。

背景

IA类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是由p110催化亚基和p85型调节亚基组成的异二聚体。p85调节亚基具有两种相反的功能：它既能稳定p110，又能抑制其基础催化活性。p85包含两个SH2结构域，其两侧是与p110紧密结合的SH2间螺旋卷曲区。在静息状态下，这种SH2-p110结构域使催化亚基处于抑制构象。酪氨酸磷酸化肽与p85的任一SH2结构域结合即可解除这种抑制，诱导p85/p110二聚体从抑制状态转变为去抑制状态，并使p110活性恢复到与未结合的单体p110相当的水平。这种激活性的磷酸酪氨酸结合在生理条件下发生：当生长因子或激素刺激受体酪氨酸激酶及其衔接蛋白发生酪氨酸磷酸化时，p85的SH2结构域被募集到质膜上的磷酸化受体复合物，从而将PI3K定位并激活于受体结合位点。对癌细胞系中酪氨酸磷酸化的大规模磷酸化蛋白质组学分析发现，p85的酪氨酸458和p55调节亚型的相应酪氨酸199是该激活过程中发生磷酸化的位点，这为PI3K通路激活提供了一个特异性的、可检测的标志物。由于 PTEN 通过使活化的 PI3K 的 PIP3 产物去磷酸化来拮抗该通路，并且由于 PTEN 功能的丧失在人类癌症中很常见，因此 p85/p55 在这些酪氨酸上的磷酸化状态可作为肿瘤细胞中组成型 PI3K 通路激活的指标。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15592455/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9488453/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%