Phospho-RAB8A (Thr72) Antibody [A18L3]
目录号: F2499
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MEF, Lane 2: MEF (MLi-2, 100 nM, 90 min)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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24 kDa
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| 阳性对照 | MEF cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-RAB8A (Thr72) Antibody [A18L3] 仅识别 Thr72 处磷酸化的内源性 RAB8A 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，纤毛，细胞质，胞质囊泡，细胞骨架，内体，高尔基体，溶酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P61006 |
| 克隆号 |
|---|
| A18L3 |
| 别名 |
|---|
| MEL; RAB8; RAB8A; Ras-related protein Rab-8A; Oncogene c-mel |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化 RAB8A (Thr72) 是 Rab 家族小 GTP 酶 RAB8A 的 II 型螺旋上由 LRRK2 催化的修饰，它在神经元、上皮细胞和脂肪细胞中发挥着关键的调控作用，将激酶信号传导与极化膜运输、纤毛发生和代谢适应相偶联。在帕金森病突变体中，LRRK2 过度激活会磷酸化 Thr72，从而破坏 Rab8 的鸟苷酸交换因子 (GEF) 活性，同时募集效应蛋白 RILPL2 结合，将 GTP-Rab8A 从膜结合位点隔离，并将其重定向至溶酶体脂质储存途径；这种磷酸化将 Rab8A 锁定在一种构象中，损害了 GTP 水解和效应蛋白相互作用，而这些相互作用对于初级纤毛的组装和 GLUT4 囊泡的胞吐至关重要。在极化上皮细胞中，pThr72-Rab8A 限制了 BBSome 介导的 IFT 运输，缩短了纤毛长度，同时促进了蔗糖酶-异麦芽糖酶等顶端货物在 Golgi 体中的滞留。胰岛素刺激通过 AS160 去磷酸化瞬时激活 Rab8A，从而驱动 GLUT4 转位，且该过程独立于 Thr72 的状态。这种修饰整合了 LRRK2 信号通路和纤毛 hedgehog/Wnt 通路，其中磷酸化缺失的 T72A 突变体可恢复 LRRK2 G2019S 细胞的纤毛发生，而磷酸化模拟突变体 T72D 则模拟了疾病相关的运输缺陷。 Thr72 磷酸化通过 optineurin 介导的自噬和营养过剩期间的脂肪细胞脂滴生物合成来调节神经元树突的生长，使其成为研究人员通过 Phos-tag 凝胶或邻近连接分析来量化 iPSC 衍生的中脑类器官中 LRRK2 通路参与的精确药效学生物标志物。 |
| 参考文献 |
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